結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移p53基因治療磁共振療效監(jiān)測的動物實驗研究.pdf

1、研究背景： 結(jié)腸癌是嚴(yán)重危害人類健康和生命的主要腫瘤之一，對于結(jié)腸癌的治療，現(xiàn)在對早期發(fā)現(xiàn)的病例仍多以外科手術(shù)作為首選，但目前結(jié)腸癌就診時多數(shù)患者已處于中晚期。對于肝轉(zhuǎn)移患者，僅10％可行手術(shù)5，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，而化療、放療、免疫等治療的副作用較大，效果也有限。通過恢復(fù)抑癌基因的功能來抑制腫瘤的發(fā)展或恢復(fù)其正常細(xì)胞表型的抑癌基因的基因治療10為這些患者治療提供了一個新選擇。p53基因，作為重要的抑癌基因之一，文獻(xiàn)報道其突變與5

2、0％的人類惡性腫瘤相關(guān)11.12。現(xiàn)p53的基因治療以重組人p53腺病毒(rAd-p53)研究最多，進展最快，并且已經(jīng)應(yīng)用于部分腫瘤的治療，目前對于結(jié)腸癌以及結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移治療也已經(jīng)開始進行研究。對于腫瘤的治療效果的評價，我們需要一種客觀的影像評價手段，但目前的超聲、磁共振、CT等檢查方法，均主要從形態(tài)學(xué)觀察腫瘤的變化，對于腫瘤接受非手術(shù)治療(化療、放療、基因治療等)后的變化，顯示往往不夠敏感。若需要早期監(jiān)測非手術(shù)治療后腫瘤的變化，則需要

3、一種能從代謝或從分子水平了解腫瘤情況的影像檢查手段。 研究目的： 1、體外分析rAd-p53對結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，探明p53基因治療對腫瘤的治療效果。 2、建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)荷瘤裸鼠模型，供影像成像研究、其他實驗研究使用。 3、探討利用現(xiàn)有條件進行荷瘤裸鼠MR成像的方法，包括普通MRI成像以及彌散加權(quán)成像(DWI)，評估DWI在基因治療早期療效監(jiān)測的價值。 4、比較經(jīng)靜脈注射、瘤內(nèi)直接注射兩種方

4、法的基因?qū)胄Ч?，初步研究rAd-p53最佳導(dǎo)入途徑，為進一步的擴大實驗和臨床應(yīng)用的基因?qū)敕椒ㄌ峁┮罁?jù)。 材料與方法： 1、rAd-p53對人結(jié)腸癌細(xì)胞的體外藥敏試驗 選用p53突變型的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，rAd-p53選用深圳賽百諾公司生產(chǎn)的重組人p53腺病毒注射液(注冊名為今又生)。以不同效靶比(0～300)的rAd-p53轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞SW480，72h后以MTT法測量光吸收值(OD值)，得出不同效靶

5、比轉(zhuǎn)染時的生長抑制率，從而選定一個較有效的轉(zhuǎn)染效靶比。然后用此效靶比按照同樣方法再次轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，72小時后以流式細(xì)胞術(shù)行細(xì)胞凋亡檢測以及細(xì)胞周期分析。 2、SW480結(jié)腸癌荷瘤裸鼠模型的建立 種瘤鼠的制備采用培養(yǎng)細(xì)胞移植法，皮下注入SW480細(xì)胞懸液。 荷瘤鼠制備：約2周后種瘤鼠成瘤后，取種瘤鼠皮下腫瘤切成相同大小的組織塊，經(jīng)皮切開種植在裸鼠肝臟，定期觀察，待腫瘤長至一定大小后進行治療。 3、荷瘤裸鼠分

6、組以及給藥 將45只裸鼠隨機分成9組，每組5只，第1～3組：空白對照；第4～6組：鼠尾靜脈給藥；第7～9組：腫瘤直接給藥導(dǎo)入rAd-p53；每隔24小時在三個不同的給藥組各選出1組進行MR掃描，掃描后立即處死并且取肝臟標(biāo)本做病理檢查。 4、影像檢查 磁共振成像設(shè)備：Philips Gyroscan Intera 1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描儀，使用C3線圈(內(nèi)直徑11cm，外直徑14cm)。常規(guī)掃描TlWI橫斷位，T

7、2WI橫斷位、矢狀位以及冠狀位。DWI采用橫斷位掃描，DWI序列所用的b值為0、400s／mm2，掃描后重建ADC圖測量腫瘤的ADC值。 5、荷瘤裸鼠肝臟腫瘤標(biāo)本的病理檢查方法 病理HE染色切片，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡情況；應(yīng)用WESTERN BLOT的方法檢測p53的表達(dá)情況。然后對各注藥組進行比較，初步定出基因治療結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移時rAd-p53的最佳導(dǎo)入途徑。將各注藥組的病理結(jié)果與DWI檢查

8、結(jié)果結(jié)合分析，評價DWI檢查對于基因治療后早期療效監(jiān)測的應(yīng)用價值。 6、統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。(1)對體外藥敏試驗MTT比色法的光吸收值資料采用單因素方差分析，不同效靶比組的兩兩比較行最小有意義差異(1east significance difference,LSD)-t檢驗。(2)對SW480荷瘤裸鼠模型各給藥組腫瘤體積大小、磁共振DWI的ADC值、HE切片所見的腫瘤壞死

9、范圍、TUNNEL法檢測所見的腫瘤細(xì)胞的凋亡比率以及WESTERN BLOT檢測的p53的表達(dá)情況的對比采用完全隨機化設(shè)計資料的K-W秩和檢驗，同一時間點的各給藥組以及同一給藥組各時間點的兩兩比較采用Wileoxon秩和檢驗。 結(jié)論： 1、rAd-p53對p53基因突變的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株的生長有一定的抑制作用，其抑制作用主要是通過誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的凋亡以及阻滯細(xì)胞廚期，使細(xì)胞停留在G0-G1期，不能進入S期而達(dá)

10、到的。 2、通過肝內(nèi)移植腫瘤的方式可以建立SW480荷瘤裸鼠的模型，rAd-p53的導(dǎo)入可以通過引起SW480結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤壞死、腫瘤細(xì)胞的凋亡，對腫瘤起一定抑制生長的治療效果。 3、rAd-p53的導(dǎo)入有多種方式，瘤內(nèi)給藥無論在引起腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡以及p53在腫瘤內(nèi)的表達(dá)方面，效果都明顯比靜脈給藥好，說明瘤內(nèi)給藥靶向性較強，為有效的導(dǎo)入方式。 4、磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)可以從分子水平探測腫瘤內(nèi)部