高機械指數(shù)超聲造影對結腸癌肝轉移影響的實驗研究.pdf

1、背景： 目前普遍認為，腫瘤的生長存在兩個明顯不同的階段，即無血管的緩慢生長階段和有血管的快速生長階段。前者主要依靠彌散供氧，氧的最大彌散距離為150μm，當腫瘤直徑超過1-2mm時，其繼續(xù)生長就需要血液供應。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)實體瘤在缺少血管的情況下，生長擴散受到了極大限制，在有血管的情況下，其瘤體增長迅速。正常人體的血管內(nèi)皮細胞倍增時間為一年，而腫瘤的血管內(nèi)皮細胞倍增時間僅四天。因此，阻斷腫瘤血供，從而抑制腫瘤的生長是目前研究

2、的熱點之一。 惡性腫瘤肝轉移的途徑主要是通過局部擴散轉移、淋巴道轉移、血道轉移和癌細胞脫落形成種植轉移等。肝臟是人體最大的實質性臟器，門靜脈及肝動脈雙重血液供應的特點使其成為許多惡性腫瘤轉移的主要部位。而結腸癌引起的肝轉移又是肝臟最常見的血道轉移方式。文獻報道約10％～25％的結直腸癌患者在接受原發(fā)灶的手術治療時已經(jīng)出現(xiàn)了肝轉移，另有約25％的患者在術后隨訪中發(fā)現(xiàn)肝轉移，50％以上的結直腸癌最終發(fā)生肝轉移，而肝轉移是結直腸癌死亡

3、的主要因素之一。因此，抑制結腸癌肝轉移是提高結腸癌遠期療效的關鍵問題之一。 近幾年，隨著超聲造影技術的發(fā)展和新型超聲造影劑的面市，關于微泡造影劑生物學效應的問題也逐漸引起人們的重視，超聲造影在肝臟疾病診斷中得到了較廣泛的應用，并取得了長足的進步。超聲的物理特性和生物學效應(熱效應、空化效應、機械效應等)的運用已滲透到了人體保健、疾病預防、疾病治療(包括體外碎石、止血、腫瘤切除等)、生物技術(如基因轉染)等醫(yī)學領域。超聲造影微泡不

4、僅作為一種人為的空化核，降低超聲的空化閾值，增強空化效應，并減少產(chǎn)生空化效應所需的超聲能量；超聲空化效應本身對周圍組織細胞可產(chǎn)生各種生物學效應，運用高機械指數(shù)超聲造影對原發(fā)灶進行間歇輻照，增強超聲空化效應，可能對結腸癌肝轉移產(chǎn)生抑制效應。 目的： 本實驗在建立轉移性肝癌動物模型的基礎上，采用高機械指數(shù)超聲造影對其原發(fā)灶進行間歇輻照，希望通過微泡增強的空化效應，引起腫瘤組織及其周圍腫瘤微血管的破壞。并經(jīng)體外實驗觀察對腫瘤細

5、胞遷移運動、增殖、凋亡、以及細胞微絲、微管等細胞骨架的影響，進一步探討高機械指數(shù)超聲造影增強空化效應，是否能夠導致腫瘤肝轉移的數(shù)目及大小的改變，為抑制腫瘤肝臟轉移探索新的手段。 方法： 1.高機械指數(shù)超聲造影對結腸癌肝轉移動物體內(nèi)的實驗研究： (1)轉移性肝癌動物模型的制備：結腸癌Lovo細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的細胞作為實驗研究。研究對象為62只正常雄性SD大鼠(體重

6、200～250g)，其中10只在SD大鼠脾臟直接接種結腸癌Lovo細胞后第2天、第4天及第6天分別脫頸處死，解剖SD大鼠肝臟，觀察轉移灶的數(shù)目及大小，確定最佳輻照時間。 (2)實驗分組：隨機分為4組(對照組、微泡+超聲組、單純超聲組和單純微泡組)，每組12只。其中微泡+超聲輻照組的SD大鼠在接種結腸癌Lovo細胞第4天時，用8％的硫化鈉給予SD大鼠腹部脫毛，1％戊巴比妥鈉40mg/kg進行腹腔注射麻醉，將SD大鼠仰臥固定于木板上

7、，經(jīng)尾靜脈注入SonoVue造影劑(1ml/kg)后，用高頻探頭尋找脾臟定位后，轉換為相控陣探頭，將探頭置于SD大鼠脾臟處，固定頻率為1.5MHz，機械指數(shù)為1.7，顯像深度固定在4cm。經(jīng)SD大鼠尾靜脈快速推注SonoVue造影劑(1ml/kg)，隨后推注1ml生理鹽水沖洗管道，輻照6s，間歇6s，共20次。 (3)將分組處理后的SD大鼠肝臟及脾臟采用HE染色，進行病理組織學檢查及透射電鏡觀察其超微結構的變化。 2.高

8、機械指數(shù)超聲造影對惡性腫瘤影響的體外實驗： (1)結腸癌Lovo細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％滅活的新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細胞，觀察細胞折光性強，將其分為4組(對照組、微泡+超聲組、單純超聲組和單純微泡組)，其中微泡+超聲組在采用ViVidFive型彩色多普勒超聲儀，調(diào)節(jié)超聲探頭頻率為1.5MHz，機械指數(shù)為1.7，顯像深度固定在4cm，用醫(yī)用膠帶將探頭環(huán)形纏繞呈現(xiàn)一凹槽，將耦合劑置于槽內(nèi)，使得培養(yǎng)板與耦合劑充分接

9、觸，超聲輻照6s，間歇6s，共20次。 (2)采用細胞遷移運動試驗(Transwell法)和激光共聚焦顯微鏡檢測細胞遷移運動能力及對結腸癌Lovo細胞微絲、微管的影響。 (3)細胞增殖試驗(MTT法)檢測腫瘤細胞增殖活性的變化。 (4)流式細胞儀檢測結腸癌細胞周期及凋亡，觀察G1期、S期及G2/G1期細胞比例的變化。 結果： 1.高機械指數(shù)超聲造影對結腸癌肝轉移影響的動物實驗研究顯示： (

10、1)將62只正常雄性SD大鼠，其中10只經(jīng)脾臟直接接種結腸癌Lovo細胞后第2天、第4天及第6天分別脫頸處死，解剖SD大鼠肝臟，發(fā)現(xiàn)在接種結腸癌Lovo細胞第4天即可見少數(shù)白色結節(jié)轉移灶，直徑在1-2mm左右，取此時為最佳輻照時間。余52只SD大鼠除4只因麻醉意外死亡，其余48只納入實驗研究，而其中41只于接種結腸癌Lovo細胞14天后，解剖肝臟均發(fā)現(xiàn)直徑1～5mm的白色結節(jié)狀轉移灶，成功率為85.4％。 (2)分組處理后10天

11、，將SD大鼠脫頸處死，對照組肝臟可見多個局灶性灰白色的微小轉移灶、病灶直徑在2～5mm之間。微泡+超聲輻照組肝臟可見腫瘤微小轉移灶的數(shù)目明顯減少，直徑均在1～2mm之間。微泡+超聲輻照組與對照組比較腫瘤數(shù)目及大小顯著減少(P＜0.01)，單純超聲組及單純微泡組與對照組比較腫瘤數(shù)目、腫瘤大小差異沒有顯著意義(P＞0.05)。 (3)將對照組、微泡+超聲組、單純輻照組及單純微泡組分組處理后10天，解剖SD大鼠肝臟及脾臟作病理學檢查。

12、各組大鼠肝臟內(nèi)均有腫瘤細胞生長，瘤細胞多呈圓形或橢圓形，呈團狀分布，但在微泡+輻照組肝臟腫瘤細胞明顯減少，脾臟組織內(nèi)出現(xiàn)大片出血壞死及明顯血栓形成，對照組、單純輻照組及單純微泡組的血栓數(shù)量明顯少于微泡+超聲組。 (4)透射電鏡觀察脾臟組織超微結構的改變：對照組透射電鏡可見腫瘤細胞核大，胞漿和胞核比例減小，線粒體較多，未見腫脹。內(nèi)皮細胞形態(tài)規(guī)則，之間連接緊密，線粒體正常。微泡+超聲組透射電鏡可見明顯的超微結構的破壞，腫瘤細胞除具有

13、對照組特點之外，線粒體明顯腫脹，呈球狀。內(nèi)皮細胞形態(tài)多樣，緊密連接斷開，線粒體腫大。單純超聲組、單純微泡組與對照組之間無顯著差別。 2.高機械指數(shù)超聲造影對結腸癌Lovo細胞遷移運動、增殖及凋亡的影響： (1)采用Transwell法發(fā)現(xiàn)，對照組Lovo細胞數(shù)發(fā)生明顯遷移，而進行微泡+超聲輻照后Lovo細胞遷移數(shù)明顯減少(P＜0.01)，微泡+超聲輻照組可見大量懸浮不透亮的死亡細胞；而單純超聲組細胞遷移數(shù)和單純微泡組的細

14、胞遷移數(shù)目與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。 (2)用激光共聚焦顯微鏡檢測各組，細胞內(nèi)微絲蛋白F-actin的表達，結果顯示：對照組微管染色表現(xiàn)為細胞致密的絲狀網(wǎng)絡結構，向細胞邊緣呈放射性延伸；單純超聲組與單純微泡組與對照組無明顯差別；微泡+超聲組微管表達較對照組減弱、稀疏，網(wǎng)絡樣結構主要沿細胞長軸排列。對照組細胞微絲染色表現(xiàn)為細胞致密網(wǎng)絡狀細絲樣結構，向四周伸出許多細短的毛刺狀突起，有明顯的拉絲狀和方向性；單純超聲組與

15、單純超聲微泡組與對照組無明顯差別；微泡+超聲組Lovo細胞胞質中部的網(wǎng)絡狀細絲明顯減少，熒光暗淡，細短的毛刺狀突起明顯減少。 (3)MTT法檢測細胞增殖活性結果顯示，對照組細胞PI增殖指數(shù)明顯多于微泡+超聲組(P＜0.01)，而單純超聲組細胞增殖數(shù)和單純微泡組的細胞增殖指數(shù)與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。 (4)流式細胞儀檢測各組結腸癌Lovo細胞周期及凋亡的改變，結果顯示：對照組G1期細胞比例顯著降低(P＜0

16、.01)，而S期細胞比例顯著增高(P＜0.01)；單純超聲組和單純微泡組與對照組各細胞周期的比例無顯著差異(P＞0.05)；與對照組相比，微泡+超聲輻照組G1期細胞比例顯著增高(P＜0.01)，S期細胞比例顯著降低，且凋亡峰與對照組相比較明顯增高(P＜0.01)。 結論： 1.高機械指數(shù)超聲造影能夠引起轉移性肝癌的數(shù)目、大小發(fā)生改變，抑制腫瘤肝轉移； 2.高機械指數(shù)超聲造影能夠引起原發(fā)腫瘤組織壞死，促進腫瘤內(nèi)部及