胡蘿卜sⅡ基因啟動(dòng)子功能區(qū)分析.pdf

1、胡蘿卜可生食，耐儲(chǔ)藏，產(chǎn)量高，易種植，而且是重要的嬰幼兒早期食品，同時(shí)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜對(duì)環(huán)境具有更高的安全性等優(yōu)點(diǎn)，因此可以作為優(yōu)良的生產(chǎn)口服疫苗的植物載體，但是適合在胡蘿卜中，尤其是在胡蘿卜直根中特異表達(dá)外源蛋白的啟動(dòng)子元件并不成熟。目前用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的啟動(dòng)子主要是組成型啟動(dòng)子(如花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子)，相對(duì)于組織特異性啟動(dòng)子，它易造成植物營養(yǎng)浪費(fèi)。因此我們選擇了胡蘿卜直根特異表達(dá)的液泡轉(zhuǎn)化酶Ⅱ型同工酶(sⅡ)基因的

2、啟動(dòng)子，并希望利用該啟動(dòng)子建立一個(gè)了胡蘿卜直根特異性高效表達(dá)體系。 本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)已發(fā)表的s Ⅱ基因的啟動(dòng)子序列，利用PCR方法擴(kuò)增得到全長啟動(dòng)子片段S1，并與GUS報(bào)告基因構(gòu)建了植物表達(dá)載體pS1，通過農(nóng)桿菌LBA4404真空滲透轉(zhuǎn)化胡蘿卜不同發(fā)育時(shí)期(播種后的第3，6，9，12，15，20周)的不同組織(葉片，葉柄，直根)中，3-4天后，檢測(cè)報(bào)告基因GUS的瞬間表達(dá)。同時(shí)以含有CaMV 35S啟動(dòng)子為陽性對(duì)照；以缺失CaMV

3、 35S啟動(dòng)子的N為陰性對(duì)照。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，陽性對(duì)照35S在不同發(fā)育時(shí)期，不同組織的胡蘿卜材料上均有不同程度的GUS著色；陰性對(duì)照N在三種組織中均未檢測(cè)到GUS著色；啟動(dòng)子S1只在15周的葉柄組織和直根組織中檢測(cè)到GUS著色，且在直根的形成層及木質(zhì)部著色程度較深，在周皮，韌皮部著色程度較淺。在熒光活性檢測(cè)結(jié)果表明，陰性對(duì)照N在胡蘿卜不同發(fā)育時(shí)期不同組織不表達(dá)GUS活性，而陽性對(duì)照35S則在不同發(fā)育時(shí)期的胡蘿卜葉片，葉柄及直

4、根組織都表達(dá)了較高的GUS活性。S1則表現(xiàn)出在9-15周的胡蘿卜直根表達(dá)較高的GUS活性，而且GUS活性值與35S相當(dāng)；在其它發(fā)育時(shí)期及其它組織中有較低的GUS活性值，結(jié)果證明檢測(cè)GUS活性方法是非常靈敏的。為提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胡蘿卜直根瞬間表達(dá)體系的表達(dá)效率，實(shí)驗(yàn)采用含有S1啟動(dòng)子構(gòu)建的農(nóng)桿菌LBA4404真空滲透發(fā)育12周的胡蘿卜直根根片中，通過檢測(cè)GUS熒光活性值的變化來選擇最優(yōu)條件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選定的轉(zhuǎn)化條件為：Silwet

5、 1-77濃度：0.005％，滲透壓力：0.04MP-0.06MP，滲透時(shí)間：1-4min，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時(shí)間：3-4天。由此我們利用真空滲透瞬間表達(dá)法研究了s Ⅱ基因的啟動(dòng)子在胡蘿卜中表達(dá)的組織發(fā)育特異性及在直根中的高表達(dá)活性，同時(shí)建立起一套穩(wěn)定高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胡蘿卜直根根片真空滲透瞬間表達(dá)體系。 為進(jìn)一步探詢s Ⅱ基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能，本文在全長啟動(dòng)子S1的基礎(chǔ)上，用PCR方法擴(kuò)增得到s Ⅱ基因啟動(dòng)子的5’系列缺失體(S2-

6、S7)，并與報(bào)告基因GUS融合構(gòu)建了七種植物表達(dá)載體pS2(1234bp)、pS3(674bp)、pS4(257bp)、pS5(136bp)、pS6(81bp)、pS7(56bp)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胡蘿卜直根瞬間表達(dá)體系來檢測(cè)這些植物表達(dá)載體表達(dá)GUS活性。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，除了缺失體S7沒有使胡蘿卜根片著色，其余缺失體轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根片都有不同程度的GUS著色，其中E轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根片著色范圍較小，著色程度較淺，其它缺失體之間的

7、GUS染色范圍，染色程度差異不明顯，對(duì)于直根的的四種組織來說，形成層及木質(zhì)部著色程度較深，在周皮，韌皮部著色程度較淺。GUS熒光活性測(cè)定結(jié)果表明，啟動(dòng)子S4表達(dá)載體表達(dá)了最高的GUS活性，是全長啟動(dòng)子S1的2.11倍；S2是全長啟動(dòng)子S1的1.37倍； S5與全長啟動(dòng)子S1相近；而S6僅為全長啟動(dòng)子的44.45％，但仍然顯著高于陰性對(duì)照N；S7與陰性對(duì)照N差異不顯著。由此推測(cè)在-2766bp--1234bp和一674bp--257bp兩

8、段區(qū)域可能存在負(fù)調(diào)控元件，而在-1234bp--674bp和-257bp--56bp之間可能存在正調(diào)控元件。在啟動(dòng)子缺失分析的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用5’RACE方法和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，初步確定了該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其位于翻譯起始位點(diǎn)上游26bp處的“A”。同時(shí)結(jié)合缺失分析結(jié)果和啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件(PLACE和PlantCARE)初步推測(cè)在S4-S5之間可能存在增強(qiáng)子序列。由此我們對(duì)這段序列做一個(gè)加倍，然后正向插入到S