水稻rbcs基因啟動(dòng)子的克隆、功能分析及應(yīng)用.pdf

1、生物技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，而與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物及其食品也成了環(huán)境和健康的中心議題。實(shí)現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的定向、安全、高效表達(dá)是解決轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的關(guān)鍵之一。解決這個(gè)問題的一個(gè)重要途徑是克隆使外源基因在特定器官或特定發(fā)育時(shí)期表達(dá)的啟動(dòng)子，構(gòu)建高效表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化載體，實(shí)現(xiàn)可控的遺傳轉(zhuǎn)化。 本研究內(nèi)容主要涉及水稻及擬南芥啟動(dòng)子的克隆、植物表達(dá)載體的構(gòu)建、水稻rbcs基因啟動(dòng)子功能分析、Osrbcs-cry1C

2、融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)化、對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株及其分子檢測(cè)等。主要結(jié)果如下： 1、通過PCR擴(kuò)增分別獲得水稻及擬南芥來源的rbcs基因啟動(dòng)子，分別命名為Posrbcs、Pats1A。對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩者存在的光調(diào)控元件有同有異。 2、將Posrbcs、Pats1A分別與gus基因構(gòu)成融合基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)化植株30株、28株，分別命名為1301r、1301a。GUS定性定量檢測(cè)結(jié)果顯

3、示1301r中g(shù)us基因在綠色組織中特異表達(dá)，1301a中g(shù)us基因僅在葉片和葉鞘中表達(dá)且表達(dá)量低于1301r。 3、對(duì)Posrbcs序列進(jìn)行5’端缺失，構(gòu)建5個(gè)缺失表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻。所得轉(zhuǎn)化植株分別命名為OS62、OS344、OS550、OS941、OS1320。GUS定量檢測(cè)顯示啟動(dòng)子片段越短，GUS活性越低。 4、將1301r、OS62、OS344、OS550、OS941、OS1320轉(zhuǎn)化植株的T<,1>代幼苗進(jìn)

4、行光誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明1301r、OS1320、OS941、OS550、OS344隨著光照時(shí)間的延長，GUS活性增強(qiáng)，而光照對(duì)OS62幼苗gus基因的表達(dá)無誘導(dǎo)作用；隨著啟動(dòng)子片段縮短，Posrbcs中I box、T box、GT-1結(jié)合位點(diǎn)、GATA box等光調(diào)控元件的缺失造成各時(shí)間點(diǎn)gus基因受光誘導(dǎo)后的表達(dá)降低。 5、對(duì)Posrbcs序列進(jìn)行凝膠阻滯分析結(jié)果顯示I box、T box、GT-1結(jié)合位點(diǎn)、GATA box等