牛結蛋白基因啟動子的改造及其功能分析.pdf

1、研制出肉質優(yōu)良并且高產量的家畜一貫是我們畜牧生產所尋求的目標。傳統(tǒng)的雜交育種存在諸多問題，例如周期長，效率低，易變異等。利用轉基因技術可在短期內培育出優(yōu)質的家畜，應用市場十分廣泛。高效肌肉特異性啟動子能夠啟動外源基因在骨骼肌細胞中的高效表達，對于提高轉基因家畜肉的生產具有重要意義。結蛋白是肌組織中重要的細胞骨架蛋白，是中間纖維主要成分之一，其在肌肉形態(tài)的形成與維持、肌細胞的分化凋控、細胞之間的信息傳遞等諸多方面發(fā)揮著重要作用。結蛋白基因

2、啟動子可以指導外源基因的特異性表達，但是作為畜牧生產所需的啟動子，其轉錄活性不夠，因此利用分子克隆技術對結蛋白基因啟動子片段進行改造，我們希望獲得一個具有較高啟動活性和肌肉組織特異性的啟動子。
　　本實驗以desmin300啟動子為研究對象，通過PCR擴增desmin300中含有多個正調控元件的序列，將其連入desmin300上游，構建含有多個正調控元件的序列的重組啟動子;將含有α-actin基因啟動子以及MyoG基因啟動子的部分

3、調控元件的序列，連到desmin300啟動子當中，構建含有兩拷貝調控元件的重組啟動子;將多拷貝調控元件與desmin300進行串聯(lián)，構建含有多拷貝調控元件的重組啟動子;構建真核表達載體;瞬時轉染牛骨骼肌衛(wèi)星細胞和胎兒成纖維細胞，檢測改造后的牛desmin基因啟動子的活性和肌肉特異性。
　　具體研究結果如下:
　　1.利用生物信息學分析發(fā)現牛結蛋白基因啟動子300 bp調控區(qū)有3個CTCF、1個CPBP、1個MyoD、2個EG

4、RF、1個AP2、1個Pax3、1個TFIIB、1個Sp1等轉錄因子調控結合位點。
　　2.應用PCR定點突變的方法，定點突變牛desmin300啟動子片段中的CTCF元件，并構建pGL3-desmin300-CTCF質粒，通過熒光素酶報告檢測啟動子活性發(fā)現，突變CTCF元件后，在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中的突變啟動子pGL3-desmin300-CTCF的活性低于野生型單啟動子pGL3-desmin300，證明CTCF轉錄元件為牛des

5、min啟動子的正調控元件。
　　3.我們將野生型啟動子pGL3-desmin300以及定點突變后的啟動子pGL3-desmin300-CTCF，分別和含有CTCF的外源基因pMy-CTCF-GFP共轉染。結果表明，突變啟動子的活性和其與外源基因共轉染后的活性相近，而野生型啟動子和外源基因共轉染后的活性要明顯高于野生型啟動子的活性，這證明CTCF元件在結蛋白啟動子調控區(qū)內與轉錄因子調控位點相結合并對轉錄有著正調控作用。
　　4

6、.將含有α-actin基因啟動子以及MyoG基因啟動子的部分調控元件的序列，連到牛desmin啟動子當中，構建重組質粒pGL3-MD-αD①-desmin300和pGL3-αD②-αD①-desmin300。結果表明，pGL3-MD-αD①-desmin300和pGL3-αD②-αD①-desmin300的啟動子活性分別是野生型啟動子pGL3-desmin300的2.56和2.88倍，說明改造后的啟動子片段具有較高的啟動活性且具有肌肉特

7、異性。
　　5.我們進一步的又將PCR擴增的含有多個正調控元件的DOUBLE序列連入含有兩拷貝調控元件的重組啟動子中，結果發(fā)現，改造后的重組啟動子活性會進一步增強并且仍然具有肌肉特性，重組啟動子pGL3-MD-αD①-desmin300-DOUBLE3，pGL3-αD②-αD①-desmin300-DOUBLE3，pGL3-MD-αD①-desmin300-DOUBLE2，pGL3-αD②-αD①-desmin300-DOUBLE