刺參(Apostichopus japonicus)發(fā)酵飼料的制作工藝與應(yīng)用效果研究.pdf

1、本文在釀酒酵母(Saccharomgces cerevisae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和白地霉(Geotrichum candidum)對刺參(Apostichopus japonicus)安全性實驗的基礎(chǔ)上,以這四種菌株為發(fā)酵菌,通過對刺參飼料發(fā)酵效果的對比研究,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母為發(fā)酵的最佳菌種。進一步探討了釀酒酵母發(fā)酵刺參飼料的工藝參數(shù),并分別研究了飼料前處理(

2、消毒滅菌)對發(fā)酵的影響和發(fā)酵過程中大分子蛋白的降解過程。進行了發(fā)酵飼料以及投喂頻率對刺參生長、能量代謝和免疫影響的研究。將飼料發(fā)酵工藝應(yīng)用到稚參的規(guī)?；B(yǎng)殖中,研究發(fā)酵飼料對稚參生長的影響。本文主要的研究內(nèi)容和實驗結(jié)果如下:
　　1.以初始體重為(4.66±0.50)g的刺參為養(yǎng)殖對象,進行為期21d的發(fā)酵候選菌株的安全性實驗。將釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌和白地霉四種發(fā)酵微生物分別配制成104cfu/ml、106cfu/

3、ml、108cfu/ml的高濃度菌懸液,將健康刺參浸浴其中,以不添加任何菌懸液的為空白對照組,觀察刺參的各種不良反應(yīng)。通過對實驗過程中各組刺參的排臟率、腫嘴率和死亡率的比較發(fā)現(xiàn),只有枯草芽孢桿菌的104cfu/ml組和產(chǎn)朊假絲酵母的108cfu/ml組對刺參排臟率的影響顯著高于對照組(P<0.05),其余組與對照組的差異不顯著(P>0.05);對刺參腫嘴率的影響,除枯草芽孢桿菌的106cfu/ml組和其余三種菌株的108cfu/ml組均

4、顯著高于對照組外(P<0.05),其余組與對照組的差異均不顯著(P>0.05);除枯草芽孢桿菌和白地霉的106cfu/ml組、四種菌株的108cfu/ml組中刺參的死亡率顯著高于對照組(P<0.05)外,其余組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。并且通過計算得出,發(fā)酵飼料投喂后其中的發(fā)酵菌在養(yǎng)殖水體中最高濃度為104cfu/ml。并且,在本實驗的管理條件下四株候選菌濃度為104cfu/ml時對刺參是安全的。因此,在此濃度范圍內(nèi)四種菌株

5、均可用來發(fā)酵刺參飼料。
　　2.為尋找發(fā)酵刺參飼料最佳的微生物菌株,本實驗對釀酒酵母、產(chǎn)朊徦絲酵母、枯草芽孢桿菌和白地霉四種菌株分別發(fā)酵刺參飼料進行相關(guān)研究。在接種量為10％(V/W),含水量70%,溫度為25℃的條件下進行為期5d的發(fā)酵實驗。實驗分為五組,分別是釀酒酵母組、產(chǎn)朊假絲酵母組、枯草芽孢桿菌組、白地霉組和空白對照組,每組接種對應(yīng)的發(fā)酵微生物,空白對照組加入等量的生理鹽水。實驗期間每天對飼料的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)進行測定、

6、記錄,理化指標(biāo)主要包括干物質(zhì)回收率(DMR)、粗蛋白(CP)、氨基酸態(tài)的氮在總氮中所占的百分比(AA-N/tN)、氨態(tài)氮在總氮中所占的百分比(NH3-N/tN)、發(fā)酵菌在微生物總量中所占的比例和弧菌在微生物總量中所占的比例,感官指標(biāo)主要包括顏色、氣味和黏度。結(jié)果顯示,在發(fā)酵的第3d釀酒酵母組的 DMR、CP、AA-N/tN均達到最高水平,發(fā)酵菌所占比例僅次于產(chǎn)朊假絲酵母組,N H3-N/tN和弧菌所占比例也在理想的范圍內(nèi)。同時,氣味、顏

7、色等感官指標(biāo)的綜合評分達到最高值。因此,在本研究中釀酒酵母是刺參飼料發(fā)酵的最適宜的菌株。
　　3.本研究采用上述篩選的最適菌株釀酒酵母為發(fā)酵菌種,分別在飼料含水量(以干物質(zhì)計)為50%、60%、70%、80%,溫度為20℃、25℃、30℃、35℃,時間為1d、2d、3d、4d、5d的條件下,開展刺參飼料發(fā)酵條件優(yōu)化的研究。按照10%(V/W)的接種量接入釀酒酵母種子液,分別對不同含水量、不同溫度和不同發(fā)酵時間條件下發(fā)酵飼料的理化指

8、標(biāo)和感官性狀評價指標(biāo)進行測定。結(jié)果表明,發(fā)酵溫度為25℃,含水量70%的實驗組在發(fā)酵時間為3d時,理化指標(biāo)中的干物質(zhì)回收率、粗蛋白含量和氨基酸態(tài)氮占總氮的含量分別達到最高值,氨態(tài)氮占總氮的含量也在理想范圍之內(nèi)。此時,發(fā)酵飼料的氣味、顏色等綜合感觀性狀指標(biāo)達到最佳水平。因此,在本實驗條件下釀酒酵母可以作為發(fā)酵刺參飼料的備選菌種,其最佳發(fā)酵條件為:環(huán)境溫度25℃、基礎(chǔ)飼料含水量70%、發(fā)酵時間3d。上述優(yōu)化的發(fā)酵飼料工藝參數(shù)將為刺參新型飼料

9、的制備提供技術(shù)參考。
　　4.本實驗采用上述優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝進行刺參飼料的發(fā)酵,每12h取一次樣,6個樣品經(jīng)過Tris-HCl緩沖液浸提、離心后得到電泳樣品。在分離膠濃度為15%、濃縮膠濃度為5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中進行大分子蛋白降解過程的研究。采用考馬斯亮藍(lán)R-250對凝膠進行染色,再經(jīng)冰醋酸脫色液處理后,觀察凝膠中的蛋白條帶的變化。結(jié)果顯示,隨著發(fā)酵的進行,大分子條帶逐漸消失;而小分子條

10、帶有所增加。說明部分大分子蛋白被降解成多肽、肽等小分子的物質(zhì)。
　　5.本實驗采用65℃濕熱滅菌30 min的方式對飼料發(fā)酵前進行消毒滅菌處理,再按照上述的最佳發(fā)酵工藝分別對經(jīng)過消毒滅菌處理和未經(jīng)消毒滅菌處理的飼料進行發(fā)酵。以不添加釀酒酵母的經(jīng)前處理和未經(jīng)前處理的飼料分別作為空白對照組。各組飼料發(fā)酵結(jié)束后,分別取樣檢測包括發(fā)酵菌和弧菌分別在微生物總量中所占比例、干物質(zhì)回收率、粗蛋白含量的理化指標(biāo)和包括顏色、氣味、黏度的感官評價指標(biāo)

11、。結(jié)果顯示,添加釀酒酵母的兩個飼料組的發(fā)酵菌所占比例、弧菌所占比例、干物質(zhì)回收率以及粗蛋白含量均無顯著性的差異(P>0.05),但分別顯著高于未添加釀酒酵母的飼料組(P<0.05);此時,在顏色、氣味和黏度方面添加發(fā)酵菌的兩個飼料組之間均無顯著差異(P>0.05)?？梢?在本實驗的半密閉發(fā)酵條件下,對飼料原料進行消毒滅菌的前處理后再進行發(fā)酵的效果不明顯。
　　6.本實驗采用發(fā)酵飼料和未發(fā)酵飼料分別投喂 A(4 g左右)、B(8 g

12、左右)、C(20g左右)三種大小不同的刺參,研究兩種飼料對三種規(guī)格刺參生長、能量分配和免疫的影響。經(jīng)過50d的投喂實驗,結(jié)果表明,在規(guī)格 A中,投喂發(fā)酵飼料刺參的特定生長率、飼料效率及實驗結(jié)束時的臟壁比均比未發(fā)酵飼料的高,攝食率、排糞率則均小于未發(fā)酵飼料的。其中,兩種飼料的飼料效率差異顯著(P<0.05)。規(guī)格B中投喂發(fā)酵飼料與未發(fā)酵飼料刺參的各生長指標(biāo)變化情況與規(guī)格 A的一致,除攝食率、排糞率外,其余生長指標(biāo)兩飼料組的差異均顯著(P<

13、0.05)。在規(guī)格C中刺參投喂發(fā)酵飼料的排糞率高于未發(fā)酵飼料的,除此之外,投喂兩種飼料的其余各生長指標(biāo)變化情況與規(guī)格 B刺參的一致。同時,從刺參大小來看,發(fā)酵飼料更有利于較小規(guī)格刺參的生長。在能量分配方面,投喂發(fā)酵飼料的三種規(guī)格刺參用于生長的能量在攝食能中所占比例均高于未發(fā)酵飼料的;同時,投喂發(fā)酵飼料的的刺參隨著規(guī)格的增大用于生長的能量逐漸減少。并且,發(fā)酵飼料能提高刺參的超氧化物歧化酶、溶菌酶等非特異性免疫酶的活性。因此,從促進刺參生長

14、和節(jié)約飼料的角度考慮,在三種規(guī)格刺參的養(yǎng)殖中發(fā)酵飼料優(yōu)于未發(fā)酵飼料。
　　7.本實驗采用發(fā)酵飼料投喂大小為(11.18±0.46) g的刺參,研究1次/2d、1次/d、2次/d三種不同投喂頻率對刺參生長、能量分配及免疫的影響。經(jīng)過50d的養(yǎng)殖實驗,結(jié)果表明,當(dāng)投喂頻率為1次/d時,刺參的特定生長率和飼料效率最高,均顯著高于其他兩種投喂頻率的(P<0.05);刺參對發(fā)酵飼料的表觀消化率隨投喂頻率的增加而逐漸下降,排糞率則呈現(xiàn)逐漸上升

15、的趨勢;投喂頻率對刺參的攝食率沒有顯著的影響(P>0.05);刺參的臟壁比在投喂頻率為1次/d時最高,并且顯著高于2次/d的(P<0.05)。投喂頻率為1次/d時,刺參的生長能、生長能在攝食能中所占比例分別顯著高于其余投喂頻率的(P<0.05)。投喂頻率在一定程度上能提高刺參的酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶等非特異性免疫酶的活性。因此,在本實驗條件下最佳投喂頻率為1次/d。在最佳投喂頻率下對刺參進行養(yǎng)殖,既能有效促進刺參的生長,又可

16、以提高飼料的轉(zhuǎn)化效率。
　　8.本實驗采用前面優(yōu)化的刺參發(fā)酵飼料的工藝對稚參飼料進行發(fā)酵,通過對發(fā)酵前后飼料的粗蛋白含量進行測定發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后飼料的粗蛋白含量顯著升高(P<0.05)。將發(fā)酵的飼料在7.5c m3的水泥池中對初始體重(3.15±0.05)kg/池的稚幼參進行規(guī)?；段箤嶒?。同時,以未發(fā)酵的稚參飼料作為對照組,每個處理組26個平行。經(jīng)過35 d的投喂實驗,結(jié)果顯示,投喂發(fā)酵飼料的幼參末體重顯著高于未發(fā)酵飼料的(P<0.