水蛭素的分離純化及其聚乙二醇修飾.pdf

1、水蛭素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的特異性最好的凝血酶抑制劑，本文對(duì)天然水蛭素的提取純化以及聚乙二醇修飾展開(kāi)研究，并對(duì)修飾產(chǎn)物的性質(zhì)進(jìn)行初步探索。 目前人們對(duì)于天然水蛭素的提取進(jìn)行了大量的研究，本文在水蛭素純化過(guò)程中，對(duì)水蛭預(yù)處理、粗提和純化步驟進(jìn)行了研究。在水蛭預(yù)處理中比較了微波、緩沖液提取、烘干、凍干四種方法，證實(shí)微波法可導(dǎo)致水蛭素失活，后三種方法對(duì)于水蛭素活力保留沒(méi)有差別。在粗提過(guò)程中，采用pH選擇法可以很好地使水蛭素活力保留，粗提液比

2、活力為3.19 ATU/mg。使用離子交換以及凝膠過(guò)濾層析法純化粗提液，經(jīng)離子交換層析后得到產(chǎn)物比活為9.1×103ATU/mg。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證實(shí)得到水蛭素純度較高。 作為最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，水蛭素存在體內(nèi)半衰期短等的藥用缺點(diǎn)。聚乙二醇修飾是目前有效地延長(zhǎng)其半衰期的方法。本文用琥珀酰亞胺活化的mPEG 5 kDa和mPEG 20kDa對(duì)水蛭素進(jìn)行化學(xué)修飾。比較了兩種方式即液相與離子交換樹(shù)脂輔助的固相修飾的結(jié)果。并優(yōu)

3、化PEG 20 kDa固相修飾的反應(yīng)條件為pH 8 PBS，HV2/SC-PEG摩爾比1:9，反應(yīng)60 min。PEG 5 kDa與PEG 20 kDa修飾相比較，產(chǎn)物產(chǎn)率較高，而單一性較低。離子交換層析結(jié)果表明，固相修飾分離度優(yōu)于液相反應(yīng)，且產(chǎn)品單一性較高，但是轉(zhuǎn)化率低于液相反應(yīng)。 體外抗凝活性分析表明，固相反應(yīng)中，無(wú)論是PEG 5 kDa，還是PEG 20 kDa修飾，活力保留率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液相反應(yīng)。另外，PEG 5 kDa修