蛋白質(zhì)藥物聚乙二醇修飾技術(shù)簡介概要

1、1,工作總結(jié)及QC崗位技能學(xué)習(xí),匯報人：劉彬彬 華僑大學(xué) 生物化工 碩士,2,藥物合成工作總結(jié),藥物聚乙二醇修飾技術(shù)及質(zhì)量控制,化工原料及產(chǎn)品分析方法建立步驟,01,02,03,目錄,CONTENTS,3,02,聚乙二醇修飾技術(shù)及質(zhì)量控制,,,,,,,,,,,4,蛋白質(zhì)藥物聚乙二醇化意義,5,聚乙二醇修飾時應(yīng)注意的問題,修飾劑的水解穩(wěn)定性和反應(yīng)活性； 蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)，修飾劑與蛋白質(zhì)上的殘基之間的反應(yīng)類型和專一性； 要求的修飾度

2、； 修飾劑與蛋白質(zhì)的連接鍵的穩(wěn)定性、毒性、抗原性；修飾后是否易于分離、純化； 是否適于建立快速、方便的分析方法； 修飾劑是否能夠簡便經(jīng)濟(jì)地合成或購買。,6,聚乙二醇修飾劑質(zhì)量控制,應(yīng)當(dāng)考慮聚乙二醇修飾劑的端基取代率和純度，藥物修飾用的聚乙二醇修飾劑其端基取代率和純度都要求至少在90%以上；要關(guān)注其分子量分布系數(shù)，應(yīng)盡可能采用分散度窄的產(chǎn)品，目前建議分散度至少控制在1.10以內(nèi)（1.05左右為佳）；應(yīng)注意聚乙二醇修飾劑批間分子

3、量的一致性，有時候分子量的批間差異對產(chǎn)品性能的影響甚至要大于分散度對產(chǎn)品性能的影響；要關(guān)注聚乙二醇修飾劑本身的穩(wěn)定性，因為在貯存、分裝和生產(chǎn)過程中，高溫、氧化和潮解都可能使其活化基團(tuán)失活，從而導(dǎo)致修飾效率大大降低。,7,常用分析儀器原理及使用,基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（Maldi-Tof-MS） 高效液相色譜（ HPLC） 氣相色譜（ GC） 凝膠滲透色譜（GPC） 紫外可見吸收光譜（UV） 紅外

4、光譜（ IR）,QC實驗室常用儀器:,8,Maldi-Tof 質(zhì)譜分析技術(shù),田中耕一（日本）,約翰·貝內(nèi)特·芬恩（美國）,2002年諾貝爾化學(xué)獎發(fā)展對生物大分子進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)分析的方法，建立了軟解析電離法對生物大分子進(jìn)行質(zhì)譜分析。,9,Maldi-Tof 質(zhì)譜原理Maldi-Tof 中基質(zhì)的作用,Maldi-Tof 質(zhì)譜分析技術(shù),,1、把樣品分子彼此分開，削弱樣品分子之間的作用力；2、基質(zhì)吸收激光能量

5、，并將部分能量傳遞給樣品；3、幫助樣品離子化。,,10,Maldi-Tof 質(zhì)譜應(yīng)用,檢測糖蛋白,,,11,Maldi-Tof 質(zhì)譜應(yīng)用,檢測核酸,12,Maldi-Tof 質(zhì)譜應(yīng)用,檢測聚合物,13,Maldi-Tof 質(zhì)譜應(yīng)用,檢測小分子藥物,Sample (exp. Mass=448.1Da). Matrix: DHB,14,Maldi-Tof 質(zhì)譜應(yīng)用,鑒定和分類微生物,15,高效液相色譜（HPLC）原理,基本原理：溶于流動相

6、（mobile phase）中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相（stationary phase）發(fā)生作用（吸附，分配，離子吸引，排阻，親和）的大小，強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。,16,高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)組成,17,高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)組成,18,高效液相色譜（HPLC）流動相,HPLC 流動相類別： 1、按流動相組成分：

7、單組分和多組分； 2、按極性分：極性、弱極性、非極性； 3、按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫可提高柱效的方法 1、除去柱上端固定相變色部分 (約3mm左右)，再補(bǔ)充新的固定相。 2、色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn) 行洗凈。 3、采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始

8、 溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。,19,儀器維護(hù)流程圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,吸濾頭,,單向閥,,柱塞密封圈,,線路過濾器,,進(jìn)樣器,檢測器,,,,20,氣相色譜（GC）原理圖,21,氣相色譜（GC）常見問題,為什么程序升溫可以更好的實現(xiàn)混合物的分離？恒溫氣相色譜的柱溫恒定在試樣平均沸點(diǎn)，如試樣的沸程很寬，則低沸點(diǎn)組分因柱溫太高而色譜峰窄，相互重疊，而高沸點(diǎn)組

9、分又因柱溫太低，洗出很慢，有些甚至不能洗出，如果采用程序升溫，采用足夠低的初始溫度，低沸點(diǎn)組分最先洗出，得到很好分離，隨著柱溫升高，較高沸點(diǎn)的組分也能較快洗出，得到良好的峰形。氣譜峰的拖尾與哪些因素有關(guān)？如何消除？與載體、樣品類型、進(jìn)樣量等因素有關(guān)。樣品含脂肪烴、芳香烴、烯烴等成較弱的拖尾；含羥基、羧基的醇、酸等嚴(yán)重拖尾。進(jìn)樣量小，拖尾弱，進(jìn)樣量大，拖尾嚴(yán)重。應(yīng)盡量減少進(jìn)樣量，形成衍生物以消除氣譜峰的拖尾。,22,使用氣相色譜（GC

10、）注意事項,綜上所述，使用儀器時，應(yīng)注意：1、樣品要進(jìn)行凈化，提純；2、進(jìn)樣量要控制在一定范圍內(nèi)；3、進(jìn)樣要迅速；4、柱溫要控制在300℃ 以內(nèi)，以免損害柱子。,23,凝膠滲透色譜（GPC）,Waters 1515型凝膠滲透色譜儀,24,凝膠滲透色譜（GPC）,基本原理：凝膠滲透色譜是一種液相色譜，原理是利用高分子溶液通過一根裝填有凝膠的柱子，在柱中按分子大小進(jìn)行分離。主要特點(diǎn)：操作簡便快捷、進(jìn)樣量小；數(shù)據(jù)可靠且重現(xiàn)性好、自動

11、化程度高等。應(yīng)用領(lǐng)域：1、聚合物分子量及其分布；2、聚合物的支化度的測定；3、聚合物分級及其結(jié)構(gòu)分析；4、高聚物中微量添加劑的分析；5、測定高聚物的絕對分子量。,GPC儀的組成,25,分子量校正曲線(Log M-V曲線),GPC理想校正曲線,MW與V之間的關(guān)系,26,應(yīng)用GPC峰高法計算平均分子量,Hi： 峰高M(jìn)i：分子量,27,GPC 儀器載體,載體要求 1、良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性； 2、有一定的機(jī)械強(qiáng)度；

12、 3、不易變形; 4、流動阻力小； 5、對試樣沒有吸附作用； 6、載體的粒度愈小，愈均勻，堆積的愈緊密，色譜柱分離效率愈高。載體種類 1、交聯(lián)聚苯乙烯凝膠； 2、多孔性玻璃； 3、半硬質(zhì)及軟質(zhì)填料包括聚乙酸乙烯酯凝膠及聚丙烯酰胺凝膠； 4、木質(zhì)素凝膠等。,28,紫外可見光譜（UV）,紫外可見光譜產(chǎn)生原理： 有機(jī)化合物的紫外－可見吸收光譜，是由分子中價電子的躍遷產(chǎn)生的。電子躍遷的主要類

13、型： (1)σ→σ* (2)n→σ* (3)n→π* (4)π→π*,分子中電子的能級和躍遷圖,29,π→ π* 躍遷,躍遷所需的能量比 n→σ* 小，吸收峰在200nm附近，含有-C=C-或-C=C-的不飽和有機(jī)物都會發(fā)生這類躍遷。,分子中電子的能級和躍遷圖,30,n→ π* 躍遷,這種躍遷所需能量最小，吸收峰一般都在近紫外區(qū)，甚至在可見光區(qū)。連有雜原子的化和物 -C=O、-C=N可發(fā)生這種躍遷。有機(jī)化合物的

14、吸收光譜是建立在n→π* 或π→π* 躍遷的基礎(chǔ)上的，它們的吸收峰位于200～700nm范圍內(nèi)。,分子中電子的能級和躍遷圖,31,溶劑對吸收峰產(chǎn)生的影響,溶液的極性對吸收峰的位置有不同的影響。 1、在π→π* 躍遷中，極性的溶液能使激發(fā)態(tài)的能量降低，吸收峰發(fā)生紅移； 2、在n→π* 躍遷中，極性溶液與未成健的電子形成穩(wěn)定的氫健，降低了n 軌道的能量，使躍遷需要較多的能量，吸收峰藍(lán)移，例如水和酒精的藍(lán)移可達(dá)30nm以上

15、。溶劑還影響吸收峰強(qiáng)度和光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和未知物質(zhì)的紫外吸收光譜時，必須采用同一種溶劑。,32,紫外可見吸收光譜（UV）的應(yīng)用,定性分析：如果待測物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸收波長、吸收系數(shù)都相同，則可認(rèn)為兩者時同一物質(zhì)。有機(jī)化和物分子結(jié)構(gòu)的推斷：可用于檢出某些官能團(tuán)。,苯在乙醇中的紫外吸收光譜圖,如圖，苯在λ＝180nm和204nm處有兩個強(qiáng)吸收帶，分別稱為E1和E2吸收帶，是由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中三個乙烯的環(huán)狀共軛體系的躍遷產(chǎn)生的

16、，是芳香族化和物的特征吸收。在230～270nm處有較弱的一系列吸收帶，稱為精細(xì)結(jié)構(gòu)吸收帶，亦稱為B吸收帶。B吸收帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)常用來辨認(rèn)芳香族化和物,33,紅外吸收光譜原理（IR）,當(dāng)樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時，分子吸收了某些特定頻率的輻射，并由其振動或轉(zhuǎn)動運(yùn)動引起偶極矩的變化，產(chǎn)生分子振動和轉(zhuǎn)動能級從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷,使相應(yīng)于這些吸收區(qū)域的透射光強(qiáng)度減弱。記錄紅外光的百分透射比與波數(shù)或波長關(guān)系曲線，就得到紅外光譜圖。,傅立葉

17、變換紅外光譜儀,34,IR與UV的區(qū)別,35,產(chǎn)品QC學(xué)習(xí)資料,36,03,化工原料及產(chǎn)品分析方法建立步驟,,,,,,,,,,,37,化工原料及產(chǎn)品分析方法建立步驟,首先，查文獻(xiàn)，各個數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)先搜羅過來，然后分析，根據(jù)實驗室所擁有的儀器、試劑、設(shè)備和個人的分析技術(shù)能力，選擇出幾個比較合適的方法，一個一個試驗。然后，根據(jù)試驗結(jié)果，判斷用哪個方法比較好，再進(jìn)一步優(yōu)化條件。如果查不到文獻(xiàn)，你就要自己建立方法，分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)，看看有沒