聚乙二醇修飾?？窠?jīng)毒素rhk2a的研究.pdf

1、聚乙二醇（PEG）修飾蛋白質(zhì)技術(shù)由于能夠降低藥用蛋白在體內(nèi)的免疫原性和抗原性、提高藥用蛋白在體內(nèi)的生物利用度，已成功用于改善多種蛋白質(zhì)藥物的性質(zhì)。2000年中山大學(xué)生命科學(xué)院利用基因工程技術(shù)獲得的一種具有心血管活性的專一作用于鈉離子通道的毒素多肽——重組?？窠?jīng)毒素rhk2a，rhk2a對(duì)心臟有非常專一的作用靶點(diǎn)，能對(duì)心肌組織產(chǎn)生很強(qiáng)的正性肌力作用，作用強(qiáng)度約為洋地黃類強(qiáng)心藥西地蘭的3.5倍。在治療充血性心力衰竭方面有極好的應(yīng)用前景。為

2、解決海葵肽類毒素rhk2a臨床應(yīng)用時(shí)存在的穩(wěn)定性差，毒性較大等問題，本課題將mPEG修飾技術(shù)應(yīng)用rhk2a。 針對(duì)重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的性質(zhì)，課題采用mPEG-ALD修飾N－末端氨基。試驗(yàn)建立反向高效液相（RP-HPLC）檢測重組?？窠?jīng)毒素rhk2a蛋白濃度的方法，并主要采用RP-HPLC法分析PEG修飾產(chǎn)物的組成。以獲得最高比例的單修飾產(chǎn)物為目標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化修飾反應(yīng)條件。最終選用mPEG-ALD 5K修飾rhk2

3、a：優(yōu)選的反應(yīng)條件是pH5.0，rhk2a/mPEG反應(yīng)摩爾比1:20，反應(yīng)時(shí)間12h，還原劑氰基硼氫化鈉的添加量為30μl。在四個(gè)影響因素中，對(duì)mPEG-ALD修飾rhk2a反應(yīng)影響最大的是反應(yīng)溶液的pH值，而影響最小的因素是反應(yīng)時(shí)間。修飾產(chǎn)物用SP-650S陽離子交換層析法分離純化，并超濾除鹽、凍干濃縮后得到最終產(chǎn)物。 對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行了分子量、穩(wěn)定性、純度的測定，并建立急性心力衰竭豚鼠模型，分別對(duì)比去乙酰毛花苷注射液、重組海

4、葵神經(jīng)毒素rhk2a和mPEG-rhk2a溶液對(duì)心衰豚鼠的LVSP、±dp/dpmax的影響。研究表明，分離純化后獲得的產(chǎn)物中單一PEG修飾?？窠?jīng)毒素rhk2a占83.287％，經(jīng)MALDI-TOF-MS法檢測該產(chǎn)物為單修飾。與未修飾rhk2a相比，其室溫及37℃存放條件下，穩(wěn)定性得到很好的改善；對(duì)于心衰豚鼠，三種藥物均能提高衰竭心臟的心肌收縮力，改善心功能，而?？窠?jīng)毒素rhk2a溶液和mPEG-rhk2a溶液作用均比去乙酰毛花苷注