聚乙二醇單修飾重組水蛭素的研究.pdf

1、水蛭素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的特異性最好的凝血酶抑制劑，但由于其血漿半衰期很短，嚴(yán)重限制了其在臨床上的抗凝應(yīng)用。聚乙二醇(PEG)修飾是常用的提高蛋白和多肽類藥物血漿半衰期的方法，已有多種PEG修飾的蛋白類藥物上市，如PEG-Intron (PEGinterferon α-2b)，PEGasys (PEGinterferon α-2a)，Neulasta (pegfilgrastim，PEG G-CSF)等，通過修飾這些藥物的體內(nèi)循環(huán)半衰期和生

2、物利用度均有所增加。關(guān)于水蛭素的聚乙二醇修飾，國內(nèi)外也已開展了很多工作，但所用修飾方法多為堿性條件下修飾水蛭素的賴氨酸殘基，這將不可避免的導(dǎo)致修飾水蛭素的活性中心(Lys47)的修飾，且修飾反應(yīng)產(chǎn)物是復(fù)雜的混合物(四修飾、三修飾、二修飾和單修飾產(chǎn)物的混合物)。為了避免水蛭素活性中心的修飾、得到均一的單修飾產(chǎn)物，本文應(yīng)用了兩種修飾策略來制備聚乙二醇單修飾重組水蛭素。 首先，采用微酸性修飾策略，選擇性的修飾重組水蛭素唯一的組氨酸殘基

3、以得到單修飾產(chǎn)物。在pH 6.0條件下把單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亞胺酯(Succinimidylcarbonyl mPEG，SC-mPEG，20kDa)與重組水蛭素偶聯(lián)，反應(yīng)混合物經(jīng)一步陰離子交換色譜(IEC)分離純化得到單修飾產(chǎn)物，單修飾產(chǎn)物占修飾產(chǎn)物的94.6％。通過中性羥胺法處理，發(fā)現(xiàn)單修飾產(chǎn)物中79.71％為組氨酸修飾位置異構(gòu)體，表明該修飾策略大體上避開了重組水蛭素活性中心(Lys47)的修飾。單修飾產(chǎn)物的純度大于95％，其體

4、外抗凝活性保留率為34％。 另外，本文利用陰離子交換介質(zhì)輔助重組水蛭素的PEG修飾，以得到單修飾產(chǎn)物。在pH 6.0，20mM PBS，r-Hir：SC-mPEG=1∶3的條件下，修飾反應(yīng)和分離純化在陰離子交換介質(zhì)上偶聯(lián)以直接得到單修飾產(chǎn)物。電泳檢測修飾產(chǎn)物為單修飾產(chǎn)物，通過中性羥胺法處理單修飾產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在該微酸性條件下，修飾未發(fā)生在組氨酸殘基，根據(jù)修飾反應(yīng)理論推斷修飾位點為N-末端氨基。單修飾產(chǎn)物的純度大于95％，單修飾產(chǎn)物的