Notch1在人舌鱗癌中的作用及其與表皮生長因子受體信號的交互作用.pdf

1、Notch信號途徑在哺乳動物細胞增殖、分化和凋亡等命運決定中起關鍵作用。其異常調控可引起組織發(fā)育異常并導致腫瘤等多種疾病的發(fā)生。研究表明，Notch信號途徑的受體之一Notch1在許多腫瘤中存在異常表達，根據腫瘤的組織來源和細胞類型，Notch1可起促癌或抑癌作用。目前，Notch1已成為潛在的腫瘤治療靶點。舌鱗癌是最常見的口腔癌，Notch1在舌鱗癌中的表達和作用至今仍未明確。 近年來的研究表明，Notch1與表皮生長因子受體

2、(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信號途徑在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中存在交互作用。根據腫瘤的組織來源和細胞類型，兩者可相互協(xié)同或相互拮抗。EGFR在舌鱗癌等多種腫瘤中過表達，導致相關信號途徑異?；罨?，促進腫瘤生長、抑制細胞凋亡、導致放化療敏感性下降、引起復發(fā)及預后不良。抑制EGFR表達和(或)阻斷其相關信號途徑可抑制舌鱗癌等腫瘤的生長。目前，EGFR已成為極具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤治療靶點，通過單克隆抗體、小

3、分子酪氨酸激酶抑制劑等藥物靶向治療頭頸部鱗癌等腫瘤的研究已取得較大進展，但仍存在著藥物敏感性不高、腫瘤細胞耐藥以及藥物不良反應等問題。研究EGFR與其他信號途徑的交互作用，可能為腫瘤的多靶點分子靶向治療開辟新的途徑。Notch1與EGFR信號途徑在舌鱗癌中的交互作用至今仍未明確。 本研究探討了Notch1在人舌鱗癌中的表達和作用及其與EGFR信號途徑的交互作用，為揭示口腔癌的分子病理機制及口腔癌的多靶點分子靶向治療研究提供實驗基

4、礎。 第一部分Notch1和EGFR在人正常舌黏膜、舌黏膜癌前病變和舌鱗癌中的表達 目的：研究Notch1和EGFR在人正常舌黏膜、舌黏膜癌前病變和舌鱗癌中的表達。 方法：免疫組織化學方法檢測15例人正常舌黏膜、59例舌黏膜白斑和65例舌鱗癌標本中Notch1和EGFR的表達。 結果：(1)在正常舌黏膜和舌黏膜白斑標本中，Notch1的陽性表達主要位于角化層，部分顆粒層和棘層細胞也有表達，基底層細胞無表達

5、；隨上皮異常增生程度的加重，Notch1的陽性細胞率和表達水平逐漸降低(P＜0.05)．EGFR的陽性表達主要位于基底層，少見于棘層，顆粒層及角化層無表達；隨上皮異常增生程度的加重，EGFR的陽性細胞率和表達水平逐漸增高(P＜0.05)。(2)在舌鱗癌中，Notch1的陽性表達僅見于高分化和中分化標本癌巢中鱗狀化生的角化細胞及類棘層細胞，癌巢周邊細胞無表達；低分化標本中無Notch1表達；分化程度越高，Notch1的陽性細胞率和表達水平

6、越高(P＜0.05)；TNM分期越高，Notch1的陽性細胞率和表達水平越低(P＜0.05)。EGFR的陽性表達主要位于癌巢周邊細胞，處于鱗狀化生的角化細胞及類棘層細胞則無表達；分化程度越高，EGFR的陽性細胞率和表達水平越低(P＜0.05)；TNM分期越高，EGFR的陽性細胞率和表達水平越高(P＜0.05)。 結論： (1)在舌黏膜上皮中Notch1的表達誘導細胞分化。隨上皮異常增生程度的加重Notch1的表達逐漸下調

7、。 (2)在舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中Norch1表達下調，可能起抑癌作用；而鱗狀化生部位Notch1的表達可能與誘導癌細胞的分化有關。 (3)根據Notch1和EGFR的表達特點，提示兩者在舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中可能存在交互作用。 第二部分Notch1組成性活化對人舌鱗癌細胞體外生長及EGFR信號的影響 目的：研Notch1組成性活化對人舌鱗癌細胞體外生長及EGFR信號的影響。 方法：用脂質體Lipof

8、ectamineTM2000分別將編碼Notch1胞內域的真核表達質粒pRAMIC—IRES2-EGFP和對照質粒pIRES2-EGFP體外瞬時轉染人舌鱗癌細胞系Tca8113細胞，用RT—PCR檢測Notch1和EGFR的mRNA表達變化，用WesternBlot檢測Notch1及其效應子Hes1、EGFR及其下游信號分子p—ERK、以及p53蛋白的表達變化，用MTT法和流式細胞術分別檢測細胞增殖活性和凋亡情況，用免疫細胞化學檢測Tc

9、a8113細胞Notch1和EGFR蛋白的表達變化。 結果：轉染48h后，目的質粒轉染組與未轉染組相比，Notch1的mRNA和蛋白分別上調3.2倍和6.1倍，其效應子Hes1蛋白上調6.9倍，EGFR的mRNA和蛋白則分別下調12.7倍和9.3倍，其下游信號分子p—ERK蛋白下調16.6倍，而p53蛋白則上調9.7倍(均以β—actin作為內參)。目的質粒轉染組與對照質粒轉染組和未轉染組相比，Notch1的mRNA和蛋白及He

10、s1蛋白顯著上調(P＜0.05)，而EGFR的mRNA和蛋白及p—ERK蛋白顯著下調(P＜0.05)，p53蛋白則顯著上調(P＜0.05)。目的質粒瞬時轉染后，MTT法檢測顯示Tca8113細胞的增殖受到明顯抑制(P＜0.05)。轉染48h后，流式細胞術檢測顯示細胞早期凋亡率顯著增高(P＜0.05)，免疫細胞化學檢測顯示Tca8113細胞Notch1蛋白的表達上調而EGFR蛋白的表達下調。 結論： (1)Notch1組成

11、性活化抑制人舌鱗癌細胞體外增殖、誘導細胞凋亡。結合第一部分實驗，提示Notch1在舌鱗癌中起抑癌作用，可能成為潛在的治療靶點。 (2)Notch1組成性活化在上調人舌鱗癌細胞Notch1及其效應子Hes1的同時，下調EGFR及其下游信號分子p—ERK蛋白，并上調p53蛋白。結合第一部分實驗，提示人舌鱗癌中存在Notch1對EGFR信號的負向調控． 第三部分EGFR基因沉默及阻斷EGFR信號途徑對人舌鱗癌細胞體外生長及No

12、tch1信號的影響 目的：研究EGFR基因沉默及阻斷EGFR信號途徑對人舌鱗癌細胞體外生長及Notch1信號的影響。 方法：(1)實驗一：構建靶向人EGFR基因的短發(fā)卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)真核表達質粒shEGFR，用脂質體LipofectamineTM2000分別將shEGFR和作為對照的非相關序列shRNA表達質粒shNC體外瞬時轉染人舌鱗癌細胞系Tca8113細胞；(2)實驗二：用5μ

13、M和10μM濃度的受體酪氨酸激酶抑制劑AG1478分別阻斷Tca8113細胞的EGFR信號途徑；(3)對實驗一、二，用RT—PCR檢測EGFR和Notch1mRNA的表達變化，用WesternBlot檢測EGFR及其下游信號分子p—ERK、Notch1及其效應子Hes1、以及p53蛋白的表達變化，用免疫細胞化學檢測Tca8113細胞Notch1和EGFR蛋白的表達變化；(4)對實驗一，用MTT法和流式細胞術分別檢測細胞增殖活性和凋亡情況

14、。 結果：(1)轉染48h后，shEGFR轉染組與未轉染組相比，EGFR的mRNA和蛋白分別下調13.4倍和10.0倍，其下游信號分子p—ERK蛋白下調10.6倍，而Notch1的mRNA和蛋白則分別上調2.2倍和7.0倍，其效應子Hes1蛋白上調13.9倍，p53蛋白上調12.5倍。shEGFR組與shNC組和未轉染組相比，EGFR的mRNA和蛋白及p—ERK蛋白顯著下調(P＜0.05)，而Notch1的mRNA和蛋白及Hes

15、1蛋白顯著上調(P＜0.05)，p53蛋白顯著上調(P＜0.05)。瞬時轉染shEGFR后，MTT法檢測顯示Tca8113細胞的增殖受到明顯抑制(P＜0.05)；轉染48h后，流式細胞術檢測顯示細胞早期凋亡率顯著增高(P＜0.05)，細胞免疫化學顯示Tca8113細胞的EGFR蛋白表達下調而Notch1蛋白表達上調。(2)在5μM和10μM的AG1478處理后，與未處理組相比，Tca8113細胞的EGFRmRNA和蛋白的表達均無明顯改變

16、(P＞0.05)，p—ERK蛋白分別下調2.0倍和3.5倍(P＜0.05)，Notch1mRNA則分別上調1.8倍和2.7倍(P＜0.05)，Notch1蛋白分別上調1.3倍和2.9倍(P＜0.05)，Hes1蛋白分別上調4.4倍和14.8倍(P＜0.05)，p53蛋白分別上調1.8倍和13.2倍(P＜0.05)(均以β—actin作為內參)，免疫細胞化學檢測顯示Tca8113細胞的EGFR表達無明顯變化而Notch1蛋白表達上調。

17、 結論： (1)短發(fā)卡RNA介導的EGFR基因沉默下調人舌鱗癌細胞EGFR及其下游信號分子p—ERK的表達，上調p53蛋白的表達，抑制細胞體外增殖，誘導細胞凋亡。 (2)受體酪氨酸激酶抑制劑阻斷人舌鱗癌細胞EGFR信號途徑，對EGFR的表達無明顯影響，但下調其下游信號分子p—ERK蛋白的表達，而上調p53蛋白的表達。 (3)EGFR基因沉默及阻斷EGFR信號途徑，均上調Notch1及其效應子Hes1蛋白的表達