Notch1在人舌鱗癌中的作用及其與表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)的交互作用.pdf

1、Notch信號(hào)途徑在哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖、分化和凋亡等命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用。其異常調(diào)控可引起組織發(fā)育異常并導(dǎo)致腫瘤等多種疾病的發(fā)生。研究表明，Notch信號(hào)途徑的受體之一Notch1在許多腫瘤中存在異常表達(dá)，根據(jù)腫瘤的組織來(lái)源和細(xì)胞類(lèi)型，Notch1可起促癌或抑癌作用。目前，Notch1已成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。舌鱗癌是最常見(jiàn)的口腔癌，Notch1在舌鱗癌中的表達(dá)和作用至今仍未明確。 近年來(lái)的研究表明，Notch1與表皮生長(zhǎng)因子受體

2、(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信號(hào)途徑在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中存在交互作用。根據(jù)腫瘤的組織來(lái)源和細(xì)胞類(lèi)型，兩者可相互協(xié)同或相互拮抗。EGFR在舌鱗癌等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)途徑異常活化，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致放化療敏感性下降、引起復(fù)發(fā)及預(yù)后不良。抑制EGFR表達(dá)和(或)阻斷其相關(guān)信號(hào)途徑可抑制舌鱗癌等腫瘤的生長(zhǎng)。目前，EGFR已成為極具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤治療靶點(diǎn)，通過(guò)單克隆抗體、小

3、分子酪氨酸激酶抑制劑等藥物靶向治療頭頸部鱗癌等腫瘤的研究已取得較大進(jìn)展，但仍存在著藥物敏感性不高、腫瘤細(xì)胞耐藥以及藥物不良反應(yīng)等問(wèn)題。研究EGFR與其他信號(hào)途徑的交互作用，可能為腫瘤的多靶點(diǎn)分子靶向治療開(kāi)辟新的途徑。Notch1與EGFR信號(hào)途徑在舌鱗癌中的交互作用至今仍未明確。 本研究探討了Notch1在人舌鱗癌中的表達(dá)和作用及其與EGFR信號(hào)途徑的交互作用，為揭示口腔癌的分子病理機(jī)制及口腔癌的多靶點(diǎn)分子靶向治療研究提供實(shí)驗(yàn)基

4、礎(chǔ)。 第一部分Notch1和EGFR在人正常舌黏膜、舌黏膜癌前病變和舌鱗癌中的表達(dá) 目的：研究Notch1和EGFR在人正常舌黏膜、舌黏膜癌前病變和舌鱗癌中的表達(dá)。 方法：免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)15例人正常舌黏膜、59例舌黏膜白斑和65例舌鱗癌標(biāo)本中Notch1和EGFR的表達(dá)。 結(jié)果：(1)在正常舌黏膜和舌黏膜白斑標(biāo)本中，Notch1的陽(yáng)性表達(dá)主要位于角化層，部分顆粒層和棘層細(xì)胞也有表達(dá)，基底層細(xì)胞無(wú)表達(dá)

5、；隨上皮異常增生程度的加重，Notch1的陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平逐漸降低(P＜0.05)．EGFR的陽(yáng)性表達(dá)主要位于基底層，少見(jiàn)于棘層，顆粒層及角化層無(wú)表達(dá)；隨上皮異常增生程度的加重，EGFR的陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平逐漸增高(P＜0.05)。(2)在舌鱗癌中，Notch1的陽(yáng)性表達(dá)僅見(jiàn)于高分化和中分化標(biāo)本癌巢中鱗狀化生的角化細(xì)胞及類(lèi)棘層細(xì)胞，癌巢周邊細(xì)胞無(wú)表達(dá)；低分化標(biāo)本中無(wú)Notch1表達(dá)；分化程度越高，Notch1的陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平

6、越高(P＜0.05)；TNM分期越高，Notch1的陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平越低(P＜0.05)。EGFR的陽(yáng)性表達(dá)主要位于癌巢周邊細(xì)胞，處于鱗狀化生的角化細(xì)胞及類(lèi)棘層細(xì)胞則無(wú)表達(dá)；分化程度越高，EGFR的陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平越低(P＜0.05)；TNM分期越高，EGFR的陽(yáng)性細(xì)胞率和表達(dá)水平越高(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)在舌黏膜上皮中Notch1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞分化。隨上皮異常增生程度的加重Notch1的表達(dá)逐漸下調(diào)

7、。 (2)在舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中Norch1表達(dá)下調(diào)，可能起抑癌作用；而鱗狀化生部位Notch1的表達(dá)可能與誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化有關(guān)。 (3)根據(jù)Notch1和EGFR的表達(dá)特點(diǎn)，提示兩者在舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中可能存在交互作用。 第二部分Notch1組成性活化對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)及EGFR信號(hào)的影響 目的：研Notch1組成性活化對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)及EGFR信號(hào)的影響。 方法：用脂質(zhì)體Lipof

8、ectamineTM2000分別將編碼Notch1胞內(nèi)域的真核表達(dá)質(zhì)粒pRAMIC—IRES2-EGFP和對(duì)照質(zhì)粒pIRES2-EGFP體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞，用RT—PCR檢測(cè)Notch1和EGFR的mRNA表達(dá)變化，用WesternBlot檢測(cè)Notch1及其效應(yīng)子Hes1、EGFR及其下游信號(hào)分子p—ERK、以及p53蛋白的表達(dá)變化，用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活性和凋亡情況，用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Tc

9、a8113細(xì)胞Notch1和EGFR蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染48h后，目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，Notch1的mRNA和蛋白分別上調(diào)3.2倍和6.1倍，其效應(yīng)子Hes1蛋白上調(diào)6.9倍，EGFR的mRNA和蛋白則分別下調(diào)12.7倍和9.3倍，其下游信號(hào)分子p—ERK蛋白下調(diào)16.6倍，而p53蛋白則上調(diào)9.7倍(均以β—actin作為內(nèi)參)。目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，Notch1的mRNA和蛋白及He

10、s1蛋白顯著上調(diào)(P＜0.05)，而EGFR的mRNA和蛋白及p—ERK蛋白顯著下調(diào)(P＜0.05)，p53蛋白則顯著上調(diào)(P＜0.05)。目的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，MTT法檢測(cè)顯示Tca8113細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞早期凋亡率顯著增高(P＜0.05)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示Tca8113細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)上調(diào)而EGFR蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： (1)Notch1組成

11、性活化抑制人舌鱗癌細(xì)胞體外增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)，提示Notch1在舌鱗癌中起抑癌作用，可能成為潛在的治療靶點(diǎn)。 (2)Notch1組成性活化在上調(diào)人舌鱗癌細(xì)胞Notch1及其效應(yīng)子Hes1的同時(shí)，下調(diào)EGFR及其下游信號(hào)分子p—ERK蛋白，并上調(diào)p53蛋白。結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)，提示人舌鱗癌中存在Notch1對(duì)EGFR信號(hào)的負(fù)向調(diào)控． 第三部分EGFR基因沉默及阻斷EGFR信號(hào)途徑對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)及No

12、tch1信號(hào)的影響 目的：研究EGFR基因沉默及阻斷EGFR信號(hào)途徑對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)及Notch1信號(hào)的影響。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)一：構(gòu)建靶向人EGFR基因的短發(fā)卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒shEGFR，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別將shEGFR和作為對(duì)照的非相關(guān)序列shRNA表達(dá)質(zhì)粒shNC體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞；(2)實(shí)驗(yàn)二：用5μ

13、M和10μM濃度的受體酪氨酸激酶抑制劑AG1478分別阻斷Tca8113細(xì)胞的EGFR信號(hào)途徑；(3)對(duì)實(shí)驗(yàn)一、二，用RT—PCR檢測(cè)EGFR和Notch1mRNA的表達(dá)變化，用WesternBlot檢測(cè)EGFR及其下游信號(hào)分子p—ERK、Notch1及其效應(yīng)子Hes1、以及p53蛋白的表達(dá)變化，用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Tca8113細(xì)胞Notch1和EGFR蛋白的表達(dá)變化；(4)對(duì)實(shí)驗(yàn)一，用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活性和凋亡情況

14、。 結(jié)果：(1)轉(zhuǎn)染48h后，shEGFR轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，EGFR的mRNA和蛋白分別下調(diào)13.4倍和10.0倍，其下游信號(hào)分子p—ERK蛋白下調(diào)10.6倍，而Notch1的mRNA和蛋白則分別上調(diào)2.2倍和7.0倍，其效應(yīng)子Hes1蛋白上調(diào)13.9倍，p53蛋白上調(diào)12.5倍。shEGFR組與shNC組和未轉(zhuǎn)染組相比，EGFR的mRNA和蛋白及p—ERK蛋白顯著下調(diào)(P＜0.05)，而Notch1的mRNA和蛋白及Hes

15、1蛋白顯著上調(diào)(P＜0.05)，p53蛋白顯著上調(diào)(P＜0.05)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shEGFR后，MTT法檢測(cè)顯示Tca8113細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞早期凋亡率顯著增高(P＜0.05)，細(xì)胞免疫化學(xué)顯示Tca8113細(xì)胞的EGFR蛋白表達(dá)下調(diào)而Notch1蛋白表達(dá)上調(diào)。(2)在5μM和10μM的AG1478處理后，與未處理組相比，Tca8113細(xì)胞的EGFRmRNA和蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯改變

16、(P＞0.05)，p—ERK蛋白分別下調(diào)2.0倍和3.5倍(P＜0.05)，Notch1mRNA則分別上調(diào)1.8倍和2.7倍(P＜0.05)，Notch1蛋白分別上調(diào)1.3倍和2.9倍(P＜0.05)，Hes1蛋白分別上調(diào)4.4倍和14.8倍(P＜0.05)，p53蛋白分別上調(diào)1.8倍和13.2倍(P＜0.05)(均以β—actin作為內(nèi)參)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示Tca8113細(xì)胞的EGFR表達(dá)無(wú)明顯變化而Notch1蛋白表達(dá)上調(diào)。

17、 結(jié)論： (1)短發(fā)卡RNA介導(dǎo)的EGFR基因沉默下調(diào)人舌鱗癌細(xì)胞EGFR及其下游信號(hào)分子p—ERK的表達(dá)，上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 (2)受體酪氨酸激酶抑制劑阻斷人舌鱗癌細(xì)胞EGFR信號(hào)途徑，對(duì)EGFR的表達(dá)無(wú)明顯影響，但下調(diào)其下游信號(hào)分子p—ERK蛋白的表達(dá)，而上調(diào)p53蛋白的表達(dá)。 (3)EGFR基因沉默及阻斷EGFR信號(hào)途徑，均上調(diào)Notch1及其效應(yīng)子Hes1蛋白的表達(dá)