細(xì)絲蛋白A調(diào)控表皮生長因子受體活化在惡性黑色素瘤發(fā)病中的作用.pdf

1、目的:多種因素影響惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括環(huán)境因素、遺傳因素和種族因素等都扮演重要角色。大量臨床、流行病學(xué)及遺傳學(xué)研究揭示，惡性黑色素瘤屬于異質(zhì)性腫瘤，包含多種基因突變類型，可在陽光暴露程度不同的身體多部位發(fā)病，提示其發(fā)生受多致病因素影響。利用現(xiàn)代先進的基因檢測技術(shù)，深入研究惡性黑色素瘤發(fā)病的分子機制，將有助于判斷疾病預(yù)后和選擇最佳治療方案。
　　表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)和表皮生

2、長因子受體(Epidermal growth factor receptor， EGFR)是參與正常細(xì)胞和異常細(xì)胞分裂、增殖、遷移和存活的關(guān)鍵分子。EGFR與配體結(jié)合后可發(fā)生同源或異源二聚體化，導(dǎo)致其胞內(nèi)段受體酪氨酸激酶發(fā)生自身磷酸化，主要通過ERK、Akt和JNK通路傳導(dǎo)活化信號。當(dāng)其異常活化或降解抑制時，可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生。有研究證明，許多人類腫瘤中均過表達EGFR，且EGFR的表達水平與治療反應(yīng)不佳、疾病惡化及存活率

3、低相關(guān)。
　　細(xì)絲蛋白A(FilaminA，F(xiàn)LNa)是第一個在非肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的肌動蛋白結(jié)合蛋白。其可形成同源二聚體，與肌動蛋白交聯(lián)構(gòu)成動態(tài)三維立體結(jié)構(gòu)。FLNa作為腳手架可錨定90余種伴侶分子，其中包括多種細(xì)胞膜受體，調(diào)控諸如細(xì)胞形狀、細(xì)胞移動、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能和生理過程。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生不僅與EGFR持續(xù)活化、蛋白降解抑制有關(guān)，并且與FLNa構(gòu)成的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，可由于FLNa異常表達影響其與伴侶錨定聯(lián)接，

4、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。盡管已證實FLNa與導(dǎo)致惡性腫瘤的信號異常有關(guān)，但其具體機制仍有待研究。
　　我們利用不表達FLNa的人惡性黑色素瘤M2細(xì)胞株和經(jīng)FLNa基因轉(zhuǎn)染M2細(xì)胞獲得的穩(wěn)定表達FLNa的M2A7細(xì)胞進行的實驗結(jié)果顯示，雖然M2細(xì)胞EGFR蛋白表達量明顯高于M2A7細(xì)胞，但經(jīng)EGF刺激后EGFR磷酸化的量卻明顯少于M2A7細(xì)胞。此結(jié)果提示，EGFR表達量的多少并不代表其活化程度，可能還有其它因素調(diào)控著EGFR的活化，臨床上不能

5、僅僅根據(jù)EGFR的表達量來評價腫瘤患者的預(yù)后，研究調(diào)控EGFR活化的新機制具有重要的理論和實用價值。
　　為此，本實驗擬通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，改變?nèi)藧盒院谏亓黾?xì)胞FLNa的表達水平，觀察FLNa表達變化對惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響;接種裸鼠，觀察FLNa表達變化對惡性黑色素瘤細(xì)胞成瘤能力的影響;通過蛋白印跡(western blot)及免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)檢測FLNa表達變化對EGFR

6、及其下游信號磷酸化水平的影響;收集臨床資料，觀察人惡性黑色素瘤組織中FLNa表達與預(yù)后之間的關(guān)系。以期揭示FLNa與惡性黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為FLNa成為惡性黑色素瘤臨床診斷參考指標(biāo)和基因治療新靶點等提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞株增殖、遷移及侵襲的影響體外培養(yǎng)不表達FLNa的人惡性黑色素瘤M2細(xì)胞及其穩(wěn)定表達FLNa的亞克隆M2A7細(xì)胞;將表達FLNa-shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達

7、FLNa的人惡性黑色素瘤UACC647細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細(xì)胞，利用western blot驗證沉默效果。
　　1.1 體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響利用MTT法體外檢測FLNa對細(xì)胞活力的影響。實驗細(xì)胞分別接種于96孔板，血清饑餓4小時后，加入不同濃度EGF(4，20，100 nM)培養(yǎng)44小時，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去上清液，加入DMSO振蕩溶解后置于酶

8、標(biāo)儀570nm處檢測OD值。
　　利用平板克隆法體外檢測FLNa對細(xì)胞貼壁后克隆形成的影響。實驗細(xì)胞吹打混勻為單細(xì)胞懸液后分別接種于35mm培養(yǎng)皿，在含1％或10％胎牛血清培養(yǎng)基及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周，蘇木素染色后，鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)量。
　　利用軟瓊脂克隆法體外檢測FLNa對細(xì)胞非錨定增殖的影響。用含0.35％低熔點瓊脂糖的培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液后，分別接種于預(yù)先鋪有含0.6％瓊脂糖培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板，在含1％或1

9、0％胎牛血清及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周，鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)量。
　　1.2 利用劃痕法體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移的影響實驗細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板并饑餓培養(yǎng)4小時。使用無菌移液器吸頭在單層細(xì)胞上均勻劃痕，漂洗脫落細(xì)胞。無或加入EGF(20nM)繼續(xù)培養(yǎng)，定時觀察并拍照記錄至劃痕愈合，以劃痕初始寬度為1計算各時間點相對寬度值。
　　1.3 利用Transwell小室法體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞侵

10、襲的影響預(yù)饑餓的實驗細(xì)胞分別置于Transwell上室，下室加入含10％胎牛血清MEM或1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，上室未穿膜細(xì)胞用棉簽擦去，已穿膜細(xì)胞用甲醇固定、HE染色，光鏡觀察并拍照計數(shù)。
　　2.FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞EGFR信號通路分子的影響預(yù)饑餓細(xì)胞分別接受EGF(20 nM)刺激0、5、10、30分鐘，加入蛋白裂解液提取總蛋白。將等濃度等體積蛋白樣本經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。利用3％牛血清白蛋白或5％脫脂奶

11、粉封閉PVDF膜，分別加入抗磷酸化酪氨酸、EGFR、磷酸化ERK、總ERK和β-actin等一抗，4℃過夜，次日加入相應(yīng)二抗，曝光顯影，使用ImageJ軟件定量分析蛋白條帶灰度值。
　　裂解實驗細(xì)胞，向蛋白裂解液分別加入小鼠抗EGFR抗體和小鼠IgG于4℃過夜?jié)L動混勻。次日加入蛋白G瓊脂糖微珠滾動混勻。漂洗微珠后，經(jīng)加熱獲取洗脫液，用抗磷酸化酪氨酸抗體進行western blot檢測。
　　3.FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞裸

12、鼠體內(nèi)成瘤的影響將UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞分別接種于5周齡雌性BALB/c裸鼠右后肢。成瘤后每周2次測量瘤體直徑并稱重。4周后處死裸鼠，剝?nèi)×鼋M織并稱重拍照。提取瘤組織總蛋白，利用western blot檢測不同瘤組織EGFR磷酸化水平。石蠟包埋瘤組織，免疫組織化學(xué)法檢測FLNa及Ki-67表達。兩位病理學(xué)家獨立判斷FLNa和Ki-67的表達情況。采用H指數(shù)法半定量分析FLNa表達;統(tǒng)計500個腫瘤細(xì)胞內(nèi)K

13、i-67表達情況，計算其陽性表達率。
　　4.FLNa和Ki-67在人惡性黑色素瘤組織中的表達從白求恩國際和平醫(yī)院病理科選取30例惡性黑色素瘤組織標(biāo)本，采用免疫組化計數(shù)分別檢測FLNa和Ki-67的表達情況，并分析FLNa的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.FLNa促進入惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲通過穩(wěn)定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)得到沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細(xì)胞株。蛋白印跡法檢測，與親本細(xì)胞組

14、及陰性對照組相比，UACC647(KD)細(xì)胞FLNa的表達被抑制70％以上。
　　通過MTT實驗檢測，在不同濃度EGF(4nM，20nM，100 nM)刺激下，與不表達FLNa的M2細(xì)胞相比，表達FLNa的M2A7細(xì)胞均展示出更高的增殖能力;但是在無EGF刺激情況下，兩者增殖能力基本相同。類似的是，隨著將UACC647細(xì)胞FLNa沉默表達，在有或無EGF刺激下，其增殖能力均有所降低。平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成實驗均顯示，在EGF

15、刺激下，F(xiàn)LNa表達水平較高的M2A7和UACC647(ctrl)細(xì)胞形成克隆的能力均強于FLNa表達水平較低的M2和UACC647(KD)細(xì)胞。
　　通過劃痕實驗檢測，在有或無EGF刺激下，高表達FLNa的M2A7和UACC647(ctrl)細(xì)胞遷移能力均強于相應(yīng)低表達FLNa的M2和UACC647(KD)細(xì)胞;其中在EGF刺激下，劃痕后12小時M2A7細(xì)胞的劃痕相對寬度值為0，而M2細(xì)胞劃痕相對寬度值為0.58±0.03;劃痕

16、后15小時UACC647(ctrl)細(xì)胞的劃痕相對寬度值為0，而UACC647(KD)細(xì)胞劃痕相對寬度值為0.51±0.01。
　　通過Transwell小室實驗檢測，與M2細(xì)胞相比，表達FLNa的M2A7細(xì)胞穿透Matrigel基質(zhì)膠的侵襲能力約是其1.9倍(P＜0.01)。與此一致的是，沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細(xì)胞的侵襲能力較UACC647(ctrl)細(xì)胞降低了1.8倍(P＜0.01)。
　　2.FLNa

17、對人惡性黑色素瘤細(xì)胞配體誘導(dǎo)的EGFR信號通路的影響通過Western blot檢測，雖然不表達FLNa的M2細(xì)胞表達更多的EGFR，但EGF刺激后磷酸化EGFR水平卻明顯低于表達FLNa的M2A7細(xì)胞。后續(xù)進行的免疫沉淀實驗也得到了類似的結(jié)果。檢測EGFR下游信號通路中ERK磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)在EGF刺激下，M2A7細(xì)胞中磷酸化ERK水平明顯高于M2細(xì)胞。在UACC647(ctrl)細(xì)胞和沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細(xì)胞上進

18、行的實驗也得到一致的結(jié)果，隨著FLNa表達水平降低，EGF引起的EGFR和ERK磷酸化水平明顯下降，與UACC647(ctrl)細(xì)胞相比，EGF刺激10分鐘后，UACC647(KD)細(xì)胞磷酸化EGFR比率降低了70％。免疫沉淀實驗也證實了UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞中EGFR磷酸化水平的區(qū)別。與UACC647(ctrl)細(xì)胞相比，沉默F(xiàn)LNa導(dǎo)致EGF引起的UACC647(KD)細(xì)胞磷酸化ERK比率顯著降低1.

19、4倍。由此推斷， FLNa可增強EGF刺激引起的EGFR酪氨酸磷酸化水平，并活化其下游Ras-Raf-MEK-ERK通路。
　　3.FLNa促進入惡性黑色素瘤細(xì)胞裸鼠種植瘤生長通過在裸鼠皮下接種UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。與UACC647(ctrl)相比，沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長明顯減慢。免疫組織化學(xué)法檢測顯示，在UACC

20、647(ctrl)細(xì)胞形成的腫瘤組織中可見彌漫、深染的Ki-67沉著于胞核，而強陽性表達的FLNa信號分布于胞漿。與此相反的是，UACC647(KD)細(xì)胞形成的瘤組織中僅有弱陽性Ki-67和FLNa表達。經(jīng)線性統(tǒng)計分析，F(xiàn)LNa的H指數(shù)為64.33±10.59，且與Ki-67表達呈正相關(guān)（r=0.88;P＜0.01）。western blot檢測顯示，UACC647(KD)細(xì)胞所形成的腫瘤組織中磷酸化EGFR和ERK所占比率分別下降80

21、％和46％。上述結(jié)果支持沉默F(xiàn)LNa抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞體外、體內(nèi)增殖的觀點。
　　4.FLNa低表達預(yù)示惡性黑色素瘤患者較好預(yù)后經(jīng)兩位病理學(xué)家獨立分析判斷，30例惡性黑色素瘤標(biāo)本中FLNa表達的H指數(shù)為69.77±5.17。經(jīng)統(tǒng)計分析，F(xiàn)LNa表達與Ki-67表達正相關(guān)(r=0.60;P＜0.01)，而與總生存期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.45;P=0.013）。選取H指數(shù)中位數(shù)分組，高表達FLNa組患者的總生存期明顯縮短（中位生存期為

22、594天），顯著低于而低表達FLNa組患者（中位生存期為1949天;P=0.0011）。然而，本實驗未發(fā)現(xiàn)FLNa表達與患者年齡、性別和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1.增加或沉默F(xiàn)LNa的表達可增強或抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力。
　　2.沉默F(xiàn)LNa表達可抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤生長。
　　3.FLNa可通過增強EGF誘導(dǎo)的EGFR活化（磷酸化）及其下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)