基因工程改造小球藻提高其蝦青素表達(dá)量.pdf

1、蝦青素是一種次生類胡蘿卜素，具有超強(qiáng)的抗氧化性，在生物體內(nèi)能淬滅單線態(tài)氧、清除自由基，可以防止機(jī)體衰老，增強(qiáng)免疫力。同時(shí)還具有抗癌抑癌、預(yù)防心血管疾病等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健品等行業(yè)。小球藻含有蝦青素，具有生長(zhǎng)速度快、生物密度高、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是很好的生物反應(yīng)器。但是小球藻中蝦青素含量低，應(yīng)用基因工程的方法提高蝦青素含量成為近年來研究的熱點(diǎn)。
　　農(nóng)桿菌具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于藻類

2、的遺傳轉(zhuǎn)化。本研究建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小球藻遺傳轉(zhuǎn)化的方法，構(gòu)建β-胡蘿卜素酮化酶基因表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入小球藻中，提高蝦青素含量。本論文具體研究?jī)?nèi)容和成果如下:
　　1、篩選體系的確定:研究羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌和小球藻的影響，羧芐青霉素濃度為200mg/L時(shí)抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，羧芐青霉素對(duì)小球藻生長(zhǎng)無影響。研究小球藻在BBM液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中對(duì)G418的敏感性，確定在BBM液體培養(yǎng)中G418的篩選濃度為1mg/L;

3、在BBM固體培養(yǎng)基中G418的篩選濃度為2mg/L。最終確定BBM液體培養(yǎng)基中G418濃度為1mg/L和羧芐青霉素濃度為500mg/L的小球藻篩選體系;在固體培養(yǎng)基中G418濃度為2mg幾和羧芐青霉素濃度為500mg/L的小球藻篩選體系。
　　2、以GFP為報(bào)告基因，以G418抗性基因（NPTⅡ）作為篩選標(biāo)記基因，CaMV35S為啟動(dòng)子，PBI121為載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，建立小球藻遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過PCR驗(yàn)證，GFP基

4、因在小球藻內(nèi)完成基因重組;通過RT-PCR驗(yàn)證，GFP基因成功轉(zhuǎn)錄;在激光共聚焦下轉(zhuǎn)化子顯示綠色熒光，GFP基因成功翻譯。轉(zhuǎn)化200天后，陽(yáng)性鑒定依然為陽(yáng)性，GFP穩(wěn)定遺傳表達(dá)。
　　3、構(gòu)建PBI121∷35S∷PDSSP-BKT載體。PDSSP為調(diào)控八氫番茄紅素的信號(hào)肽基因，BKT為β-胡蘿卜素酮化酶基因，先通過overlap PCR技術(shù)克隆獲得PDSSP-BKT融合基因。
　　4、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，將PDSSP