固氮施氏假單胞菌鐵吸收調節(jié)蛋白Fur參與鐵轉運和固氮調控的研究.pdf

1、鐵是微生物代謝重要的金屬元素，但過量的鐵會對細胞產生毒性，因此微生物對胞內鐵平衡存在嚴謹的調控。革蘭氏陰性菌中，胞內鐵轉運、儲存和利用主要由鐵吸收調節(jié)蛋白Fur（ferric uptake regulator）調控。研究表明Fur參與了根際微生物、病原微生物的宿主定殖、侵染等生理過程，但關于Fur蛋白是否直接參與生物固氮調控未見報道。施氏假單胞菌A1501是一株根際聯合固氮菌，其高效固氮及根表定殖需要大量含鐵蛋白的參與。A1501基因組

2、擁有一個與銅綠假單胞菌fur高度同源的基因。本研究通過一系列的分子生物學方法明確了該菌中Fur的功能及信號響應機制，并初步探索了其參與鐵吸收和生物固氮調控的分子機制。取得以下主要研究結果：
　　(1)A1501菌fur的表達受環(huán)境中鐵離子濃度及RpoS的影響。通過實時定量和Western雜交的方法測定了A1501菌fur基因的表達特征，結果發(fā)現，與正常條件相比，在缺鐵情況下fur的表達量提高1倍；而在高鐵環(huán)境中fur表達僅為正常條

3、件的50％左右，表明fur表達情況與環(huán)境中鐵濃度密切相關。進一步實驗發(fā)現在rpoS突變株中fur基因與Fur蛋白的表達量均上調約2倍，表明Fur的表達受RpoS的調控。
　　(2)A1501菌中Fur參與了鐵轉運基因的表達調控。在LB中，fur突變株的生長能力與野生型相比無顯著差異。ICP-MS技術測定胞內鐵離子濃度，結果表明，突變株內鐵含量為野生型的1.3倍，表明Fur參與了胞內的鐵離子轉運。qRT-PCR分析結果表明，與野生型

4、相比鐵轉運相關基因上調至少8倍，A1501菌中Fur對鐵轉運基因存在負調控。此外，fur通過對非編碼RNA prrF的調控作用參與了菌體對氧化沖擊的響應，影響了sodB的表達。EMSA實驗證實了Fur蛋白與prrF的啟動子存在體外結合。
　?。?)fur基因參與了A1501的固氮基因表達調控。fur突變株的固氮酶活只有野生型的10%左右。突變株中固氮酶編碼基因表達下調，固氮酶蛋白水平顯著下降，表明Fur對固氮基因的表達具有調控作用

5、。對野生型和Fur突變株在固氮條件下的轉錄組進行了分析，結果表明，突變株固氮島內的48個固氮相關基因全部表達下調，而參與一般氮代謝調控系統(tǒng)的rpoN、ntrBC等基因的表達量沒有顯著的變化。其中固氮酶結構基因nifHDK等啟動子區(qū)存在可能的Fur的結合位點，通過凝膠阻滯實驗證明Fur蛋白與nifHDK的啟動子存在體外結合現象。
　　綜上，在A1501菌中，Fur蛋白是一個轉錄調節(jié)因子，具有DNA結合能力。Fur自身的表達受環(huán)境中鐵