葛根總黃酮、葛根素、大豆甙元誘導K-562細胞凋亡分子機制的初步研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia/chronic granulocyticleukemia；CML/CGL)簡稱慢粒，是一種獲得性多能造血干細胞的克隆增殖性疾病，Ph染色體t(9；22)(q34；q11)為其特征性遺傳學標志。這一特異的染色體異常產生的BCR/ABL融合基因，轉錄翻譯生成分子量為210kDa的蛋白—P210BCR/ABL。該蛋白具有很強的酪氨酸激酶(tyrosine kinase

2、，TK)活性，是CML形成的分子基礎。Bel-2基因、死亡受體及其配體Fas/FasL都是與細胞凋亡密切相關的重要信號分子。
　　 血復康是江蘇省中醫(yī)院血液科于1989年根據中醫(yī)解毒活血法獨創(chuàng)的復方制劑，主要由青黛、莪術、葛根組成。近五年課題組對血復康治療慢粒在細胞和分子水平的作用機制方面進行了較為深入的研究，證明了不同濃度、不同時段血復康處理K-562細胞(CML細胞株)后，BCR/ABL融合基因、JWA基因及抗凋亡基因Bcl

3、-2均呈濃度及時間依賴性下降；細胞形態(tài)學出現典型的凋亡特征；對血復康各組分(青黛、葛根、莪術)誘導K-562細胞凋亡的初步研究表明：三種單藥成分均能誘導K-562細胞凋亡，而且其誘導細胞凋亡的途徑不盡相同。令人感興趣的是，不同濃度葛根總黃酮(0、2.5、5.0、7.5、10、20 mg/ml)處理K-562細胞24小時后，細胞凋亡率和BCR/ABL融合蛋白均呈濃度依賴性下調；部分上調K-562細胞P53蛋白的表達，觸發(fā)了我們進一步研究其

4、可能分子機制的興趣。本課題試圖進一步從mRNA和蛋白水平研究葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元誘導K-562細胞凋亡可能的分子機制。
　　 實驗目的：1.研究不同濃度葛根總黃酮(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/ml)、葛根素(0、0.1、1.0、5.0、10 mmol/L)、大豆甙元(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)處理K-562細胞后不同時段(0、24、48、72小時)對細胞增殖和凋亡的影響

5、；2.經上述藥物處理K-562細胞后，各組BCR/ABL融合基因、Bcl-2基因在mRNA水平表達的變化；3.各組藥物處理前后P210BCR/ABL、Bel-2、Fas/FasL在蛋白水平表達的變化。分別探討不同濃度、不同時段葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元對細胞增殖、凋亡及相關細胞凋亡基因表達的影響及可能的分子機制。
　　 實驗方法：以K-562細胞株為研究對象，采用CCK-8法檢測不同濃度、不同時段葛根總黃酮及其成分葛根素

6、、大豆甙元對K-562細胞增殖的影響；Hoechst33258染色及流式細胞儀檢測細胞凋亡；半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(semi-quantitatiVe reverse transcription polymerase chain reaction，SQ-RT-PCR)檢測各組藥物作用K-562細胞前后BCR/ABL融合基因、Bcl-2基因表達的變化；Western blot檢測P210、Bcl-2、Fas/FasL蛋白的變化。

7、　　 實驗結果：1.葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元對K-562細胞增殖的影響：不同濃度、不同時段葛根總黃酮、葛根素、大豆甙元與細胞增殖抑制成正相關。2.葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元對K-562細胞凋亡的影響：①Hoechst染色結果：低濃度葛根總黃酮(1 mg/ml)、葛根素(1 mmol/L)、大豆甙元(0.5 mmol/L)處理K-562細胞48小時后，可檢測到明顯的細胞凋亡；②流式細胞儀檢測結果：不同濃度葛根總黃酮及其

8、成分葛根素、大豆甙元處理K-562細胞48小時后，細胞凋亡率呈濃度-時間正相關。3.半定量RT-PCR結果：不同濃度葛根總黃酮、葛根素處理組BCR/ABL融合基因的表達呈濃度依賴性下降；而大豆甙元處理組無明顯變化；Bcl-2基因的表達在各處理組均無統(tǒng)計學意義。4.western blot結果：葛根總黃酮、葛根素處理組P210蛋白的表達呈濃度.時間依賴性下降；而大豆甙元處理組無明顯變化；Bcl-2基因和蛋白的表達在各處理組均無統(tǒng)計學意義；

9、葛根總黃酮處理組Fas、FasL蛋白的表達呈濃度.時間依賴性上升，而葛根素、大豆甙元處理組無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：1.葛根總黃酮及其成分葛根素、大豆甙元均能抑制K-562細胞增殖、誘導細胞凋亡，并呈時間及濃度依賴性上調。2.不同濃度、不同時段葛根總黃酮、葛根素處理組在mRNA和蛋白水平均能部分抑制K-562細胞BCR/ABL的表達，說明其誘導K-562細胞凋亡的作用可能是通過部分降低酪氨酸激酶活性而實現的；而大豆甙元處理組并