棉花遺傳多樣性研究及抗黃萎病相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、遺傳多樣性的量化與分類是收集和利用種質(zhì)資源的重要前提。利用簡單重復(fù)序列(SSRs)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNAs(RAPDs)兩種分子標(biāo)記對(duì)來自我國各個(gè)棉區(qū)的30份陸地棉轉(zhuǎn)基因種質(zhì)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，材料包含有我國的現(xiàn)有的三種轉(zhuǎn)基因類型。利用NTSYS-pc2.10統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用Jaccard's相似系數(shù)UPGMA法進(jìn)行聚類。結(jié)果表明三類轉(zhuǎn)基因材料大致分為不同的兩類，而且不同棉區(qū)的轉(zhuǎn)基因材料交叉分布。相似系數(shù)分析表明，我國轉(zhuǎn)基因材料

2、的遺傳多樣性相對(duì)較為豐富。 同時(shí)利用這兩種分子標(biāo)記對(duì)31份陸地棉種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，其中14份材料是最近從美國和伊朗引進(jìn)。從有多態(tài)性的21個(gè)RAPD引物和18對(duì)SSR引物中共獲得117個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。利用NTSYS-pc2.10統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用Jaccard's相似系數(shù)UPGMA法進(jìn)行聚類。結(jié)果表明從國內(nèi)來的17份材料部分聚為一類，從國外來的14份材料大部分聚為另一類，其他材料相間排列；分別對(duì)31份材料的相似系數(shù)和來自

3、中國的17份材料的相似系數(shù)進(jìn)行了比較分析，國內(nèi)材料相對(duì)于新引進(jìn)的國外材料的遺傳多樣性水平稍高，國內(nèi)和國外材料之間的遺傳差異較大。這說明擴(kuò)大不同地區(qū)間種質(zhì)資源的交流和引進(jìn)種質(zhì)資源可以豐富本地材料的遺傳多樣性。現(xiàn)階段積極引進(jìn)、正確評(píng)價(jià)和有效利用種質(zhì)資源仍具有重要意義。 黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliaekleb.)引起的土傳性真菌維管束病害，近年來在世界上對(duì)棉花和許多作物造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和品質(zhì)損失。本研究以對(duì)

4、黃萎病有抗性的海島棉Pima90為材料，利用改良的異硫氰酸胍法抽提棉花根組織材料的總RNA。在幼苗接種黃萎病病原菌后2、4、8、12、24、48、72和96h分別取幼根以抽提棉花總RNA。以未接種病原的棉花cDNA為驅(qū)動(dòng)方，以接種病原的棉花cDNA為試驗(yàn)方，利用SSH法對(duì)接種病原后的棉花cDNA進(jìn)行差減雜交以分離對(duì)抗病反應(yīng)的基因。SSH文庫包含534個(gè)克隆，以M13引物對(duì)擴(kuò)增插入片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示插入片段大小從0.2至1.

5、2kb不等，平均大小為0.5kb。將克隆中的插入片段點(diǎn)種于尼龍膜上，分別以病原誘導(dǎo)前后的總cDNA為探針進(jìn)行反向Northern雜交。對(duì)88個(gè)在海島棉的抗病反應(yīng)中表達(dá)有差異的克隆進(jìn)行了測序并對(duì)測序結(jié)果在NCBI上利用Blastn和Blastx進(jìn)行序列相似性分析。結(jié)果表明大部分陽性克隆與擬南芥、棉花等多個(gè)物種不同逆境條件下誘導(dǎo)的相關(guān)基因或表達(dá)序列相同或同源。鑒定到一些與抗病反應(yīng)相關(guān)的基因如棉花病程蛋白家族10、擬南芥抗病反應(yīng)蛋白家族、谷胱

6、甘肽S轉(zhuǎn)移酶等。同時(shí)分離到一些參與轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子如MYB轉(zhuǎn)錄因子家族、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族WD-40repeat和Cys2/His2類的鋅指蛋白等。兩個(gè)與植物激素調(diào)節(jié)相關(guān)基因同源的EST可能在棉花抗病反應(yīng)中起作用。SSH文庫的構(gòu)建和分析將有助于了解棉花抗黃萎病反應(yīng)的分子機(jī)制。 從SSH文庫中分離到兩個(gè)海島棉受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)的基因GbPR1和GbPR2。GbPR1轉(zhuǎn)錄本長為701堿基，包含一個(gè)528堿基的完整開放閱讀框。它編碼一個(gè)1

7、76個(gè)氨基酸的多肽，其分子量為18.9kD，等電點(diǎn)為6.34。利用GeneBank的BlastX進(jìn)行同源性序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)其與擬南芥抗病反應(yīng)相關(guān)蛋白家族成員有46％的同源性且具有相同的保守結(jié)構(gòu)域Dirigent。生物信息學(xué)分析表明，GbPR1的N端具有一典型的信號(hào)肽序列?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白的N端和C端分別有一跨膜結(jié)構(gòu)，且兩者的方向都為由胞內(nèi)向胞外。蛋白N端的跨膜結(jié)構(gòu)末端與其信號(hào)肽序列位置相重疊。對(duì)該蛋白質(zhì)功能預(yù)測表明其功能與生物的免疫

8、反應(yīng)有關(guān)。Northern雜交和RT-PCR分析表明其在海島棉中受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)。GbPR2轉(zhuǎn)錄本長為804bp，包含一個(gè)522bp的完整開放閱讀框。它編碼一個(gè)174個(gè)氨基酸的多肽，其分子量為18.6kD，等電點(diǎn)為6.59。GbPR2與擬南芥抗病反應(yīng)相關(guān)蛋白家族成員有39％的同源性但具有相同的保守結(jié)構(gòu)域Dirigent。生物信息學(xué)分析表明GbPR2與GbPR1具有類似的功能和信號(hào)肽序列。GbPR1和GbPR2的最大差異位于其N端，GbP

9、R2沒有檢測到典型的跨膜結(jié)構(gòu)。MIC-3與棉花線蟲抗性相關(guān)，受線蟲誘導(dǎo)表達(dá)，但在本實(shí)驗(yàn)的SSH文庫中高頻出現(xiàn)。Northern雜交表明其也受黃萎病誘導(dǎo)，MIC-3可能是棉花基礎(chǔ)抗性反應(yīng)中的一個(gè)因子。 病程相關(guān)蛋白(PR)-10是從SSH文庫中分離到的另一基因家族。該類蛋白具有內(nèi)源核酸酶活性，已在多種植物中被分離到。它們的具體功能目前尚不清楚，但在植物的抗生物和非生物逆境脅迫中具有重要作用。鑒定到三個(gè)具全長ORF的轉(zhuǎn)錄本，它們與棉

10、花PR-10蛋白高度同源。Northern雜交和RT-PCR表明它們?cè)诤u棉根中組成型表達(dá)，但受病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)增強(qiáng)。在海島棉、陸地棉和中棉基因組的Southern雜交表明PR-10在棉屬中是一個(gè)小的多基因家族。利用ClustalX對(duì)GeneBank中的9個(gè)PR-10蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)化樹上該家族被分為三個(gè)亞家族。根據(jù)蛋白質(zhì)序列的N端、保守的病程結(jié)構(gòu)域Betv1中的GGPLGDKLEKI模體和蛋白質(zhì)C端設(shè)計(jì)合成引物。RT-PCR結(jié)果顯

11、示該基因包括一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子。利用PCR對(duì)PR-10基因在14個(gè)棉花材料，代表了11個(gè)棉種和10種基因組類型，進(jìn)行擴(kuò)增。測序結(jié)果顯示內(nèi)含子序列長度從74到98個(gè)堿基，富含T。對(duì)基因組序列的多序列對(duì)比結(jié)果與前者由蛋白序列所得結(jié)果相似，內(nèi)含子和外顯子在各個(gè)亞家族中的不同棉種中同樣保守。對(duì)植物的PR-10的進(jìn)化分析表明，PR-10在植物中進(jìn)化上相互獨(dú)立。雙子葉植物和單子葉植物的PR-10間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雙子葉植物內(nèi)的親緣關(guān)系較近。因此P