3個群體刺參遺傳多樣性分析及AIF-1基因克隆與表達.pdf

1、刺參(Apostichopus japonicus)隸屬于棘皮動物門,廣泛分布于太平洋西部的中國、俄羅斯、朝鮮、韓國與日本沿海,具有較高的營養(yǎng)和藥用價值,是我國重要的養(yǎng)殖種類之一。近年來,由于刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,個體生長速度緩慢、抗病力能力下降、疾病頻發(fā)等問題,制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此對刺參遺傳多樣性、免疫相關基因應答機制進行研究,可為刺參種質改良和疾病預防提供參考依據(jù)。
　　本研究利用核糖體內(nèi)轉錄間隔區(qū)1(ITS1)和線

2、粒體D-loop區(qū)序列多態(tài)性分析了3個不同地理群體刺參的遺傳多樣性和遺傳結構;同時克隆測序了刺參免疫相關基因同種異體移植炎癥因子-1(Allograft inflammatory factor-1,AIF-1)全長cDNA,并分析該基因在刺參不同組織、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)及組織創(chuàng)傷刺激后的表達模式。主要研究結果如下:
　　(1)利用核糖體DNA第一內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS1)序列,對中國大連(CD)、朝鮮羅津

3、(KN)和俄羅斯海參崴(RV)3個野生群體刺參的遺傳多樣性進行分析。經(jīng)PCR擴增、克隆測序,獲得長度為517-519bp、524bp兩種類型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5％)顯著高于A+T含量。在刺參30個個體61條序列中共檢測49個變異位點,多態(tài)位點比例為9.33％,其中4個簡約信息位點,共有40種基因型,群體共享基因型為2個。遺傳多樣性分析表明,3個群體遺傳多樣性豐富;分子方差分析(AMOVA)顯示,88.65％的變

4、異來自于群體內(nèi)部,群體間遺傳分化較弱或中度分化。根據(jù)群體間遺傳距離進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)KN群體與RV群體親緣關系較近,CD群體KN、RV群體親緣關系較遠。
　　(2)刺參CD、KN和RV群體遺傳多樣性的D-loop分析:對3個群體共計71頭刺參的線粒體D-loop序列進行PCR擴增和測序,獲得長度為447-465bp的D-loop序列,平均A+T含量(59.2％)顯著高于G+C含量;共檢測到119個變異位點,多態(tài)位點比例為24.24

5、％,其中簡約信息位點為53個,共有40種基因型,其中7個基因型被3個群體共享。群體遺傳多樣性參數(shù)分析表明3個群體遺傳多樣性比較豐富;利用Arlequin3.5分子方差(AMOVA)分析結果表明,3個群體間遺傳分化較弱或只有中度分化,群體分化時間為19.68-22.1萬年前。CD群體與RV群體之間遺傳距離最遠為0.042,KN群體與RV群體之間遺傳距離最近為0.0374。將本研究所得序列結合GenBank中青島(QD)和威海(WH)仿刺參

6、的D-loop序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹,QD與WH刺參首先聚為一小支,然后與CD群體聚為一大支,KN群體與RV群體聚為獨立一支,這一聚類方式符合地理隔離模式。
　　(3)采用RACE技術克隆了刺參AIF-1基因的全長cDNA序列,該序列全長1541bp,含有一個477bp的開放閱讀框,編碼158個氨基酸,蛋白計算分子量為17.92kDa,等電點為4.91,另外該基因還具有2個EF-手型鈣離子結合基序。采用實時熒光定量PCR方法分析該基因