棉花抗黃萎病相關(guān)基因GhSKIP35基因的克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、棉花是在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占重要地位的經(jīng)濟(jì)作物，黃萎病現(xiàn)已成為影響生產(chǎn)的嚴(yán)重因素之一。防治黃萎病根本方法是培育和應(yīng)用抗病品種。因此，了解棉花抗黃萎病的信號(hào)途徑，分離抗病相關(guān)基因，已成為棉花分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，SCF信號(hào)復(fù)合體作為泛素途徑一類重要的E3連接酶，在介導(dǎo)R基因的抗性、茉莉酸反應(yīng)、乙烯反應(yīng)等植物抗病反應(yīng)中起著重要作用。
　　研究以本課題組構(gòu)建的中植棉KV1 SSH文庫為基礎(chǔ)，克隆了棉花泛素途徑SCF信

2、號(hào)復(fù)合體中的GhSKIP35(Skpl-interacting partner35)基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.通過基因電子克隆、5'RACE、3'RACE成功克隆出GhSKIP35基因全長(zhǎng)。GhSKIP35基因開放閱讀框(ORF)為1863 bp，編碼620個(gè)氨基酸;通過與擬南芥、鷹嘴豆、甜橙、番茄、土豆、葡萄等10種植物SKIP35基因編碼的氨基酸序列比對(duì)有76.63％的總體同源性，并且

3、，都有相同的保守區(qū)域。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，顯示GhSKIP35與甜橙的SKIP35蛋白的關(guān)系最近，同源性最高。通過對(duì)GhSKIP35蛋白氨基酸保守區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)長(zhǎng)達(dá)100多個(gè)氨基酸的錨蛋白重復(fù)序列。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，在接種大麗輪枝菌V991菌系后初期棉花根部GhSKIP35基因表達(dá)量激增，12 h便可達(dá)到頂峰，24～48 h逐漸下降，這表明，GhSKIP35基因?yàn)辄S萎病菌上調(diào)瞬時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)基因，推測(cè)它在

4、陸地棉抗黃萎病早期防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用。
　　3.利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing)技術(shù)，在中植棉KV3中成功地沉默GhSKIP35基因;對(duì)沉默棉株接種大麗輪枝菌V991鑒定顯示，其病情指數(shù)為50.75，而野生型的中植棉KV3和轉(zhuǎn)化空載體棉株的病情指數(shù)分別為9.38和11.54。GhSKIP35基因沉默后，中植棉KV3對(duì)黃萎病的抗性由高抗水平下降到高感水平，抗性級(jí)別由最高級(jí)降到最低級(jí)