鈣在低溫脅迫三尖杉過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、三尖杉是我國(guó)一級(jí)保護(hù)樹種，具有很高的藥用價(jià)值，但是現(xiàn)存的自然資源有限，天然更新又極其困難。目前主要集中在三尖杉酯堿抗癌性能研究較多，而對(duì)于三尖杉生理活性和生化特性了解甚少，因此研究三尖杉在低溫條件下的生理生化特性，探討提高植物抗寒性的理論與技術(shù)，將對(duì)三尖杉乃至其它木本植物的抗性育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。 Ca2+作為第二信使在生物體內(nèi)起著重要的作用。而Ca2+信號(hào)對(duì)植物抗寒的作用大多數(shù)只是在一年生草本植物上得到研究，而以多年生

2、的木本植物的研究上甚少，本研究以一年生的三尖杉幼苗為材料，研究了低溫脅迫過程中鈣信號(hào)的作用機(jī)制以及為擴(kuò)大三尖杉種植資源提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，低溫鍛煉和結(jié)合CaCl2處理細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平呈現(xiàn)迅速而又短暫的上升，之后恢復(fù)到靜息狀態(tài)。在低溫脅迫2min后，低溫鍛煉和結(jié)合CaCl2處理鈣離子濃度迅速上升，結(jié)合CaCl2處理上升幅度較單純低溫鍛煉快，由120nmol/l上升到885nmol/l,.之

3、后又恢復(fù)到靜息狀態(tài)基態(tài)值120nmol/l，低溫鍛煉由120nmol/l上升到650nmol/l。而EGTA、LaCl3、CPZ完全抑制了不親和互作過程中細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]的升高，因?yàn)長(zhǎng)aCl3是質(zhì)膜Ca2+通道的抑制劑，所以[Ca2+]cyt的升高來源于外部的Ca2+，通過質(zhì)膜Ca2+通道的開放流入細(xì)胞質(zhì)。EGTA是一種質(zhì)膜上電壓依賴型(L型)Ca2+通道抑制劑，所以三尖杉葉片質(zhì)膜上的Ca2+通道為電壓依賴型Ca2+通道，同時(shí)也說明

4、在低溫脅迫過程中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化是傳遞低溫信息的前期信號(hào)。 2.隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，單純低溫、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理葉片中CaM含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，并且結(jié)合CaCl2處理在整個(gè)脅迫過程中CaM含量均顯著高于其它各個(gè)處理。在低溫脅迫72h時(shí)，鈣調(diào)素含量達(dá)到最大，EGTA、LaCl3、CPZ、單純低溫鍛煉和正常情況下生長(zhǎng)的三尖杉葉片中鈣調(diào)素含量分別比CaCl2處理降低了74.4％、33.

5、92％、37.5％、53.7％和86.3％，CaM含量的上升增強(qiáng)了植物的抗冷性。這表明Ca2+-CaM信使系統(tǒng)參與了低溫脅迫三尖杉信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過Ca2+-CaM復(fù)合體的形成傳遞信號(hào)，激活各種酶活性，增強(qiáng)了植物體抗冷性，減緩了低溫對(duì)三尖杉的傷害。 3.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理幼苗，研究了低溫脅迫過程中植物體內(nèi)保護(hù)酶活性的變化。結(jié)果表明：隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，單純低溫、

6、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理葉片中CAT、POD、SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。但結(jié)合CaCl2處理明顯提高植物體CAT、POD、SOD活性，而且保護(hù)酶活性下降也較緩慢；EGTA、LaCl3、CPZ處理則抑制了植物體內(nèi)保護(hù)酶活性的上升，說明Ca2+-CaM信使系統(tǒng)作為低溫脅迫過程中的信號(hào)分子參與低溫脅迫三尖杉幼苗的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ca2+通過形成Ca2+-CaM復(fù)合體來激活各種生理生化反應(yīng)，減緩了低溫對(duì)植物體的傷害，提

7、高植物體抗性。而EGTA、CPZ和LaCl3通過抑制Ca2+-CaM的形成使三尖杉幼苗體內(nèi)活性酶活性下降，并呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，加劇了低溫對(duì)三尖杉幼苗的傷害。 4.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理幼苗，研究了低溫脅迫過程中植物體內(nèi)O2-產(chǎn)生速率的變化。結(jié)果表明：隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，單純低溫鍛煉和結(jié)合CaCl2處理，均呈現(xiàn)先上升后下降，結(jié)合CaCl2處理減緩了O2-產(chǎn)生速率

8、；而CPZ、EGTA和LaCl3處理則增加了O2-產(chǎn)生的速率，這可能是Ca2+-CaM信使系統(tǒng)調(diào)控低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高植物體抗冷性的生理基礎(chǔ)之一。 5.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理幼苗，研究了低溫脅迫過程中植物體內(nèi)H2O2的含量的變化。結(jié)果表明：隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，單純低溫鍛煉幼苗過氧化氫含量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，變化幅度較大。結(jié)合CaCL2處理H2O2含量隨呈現(xiàn)上

9、升趨勢(shì)，但是升趨勢(shì)緩慢，始終低于LaCl3、CPZ、EGTA處理，說明Ca2+有可能通過降低植物體內(nèi)H2O2的含量，來維持植物體的正常生長(zhǎng)。 6.從三尖杉葉片中的蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE電泳可以看到，在葉面噴施CaCL2經(jīng)低溫脅迫10、30、180、360、540、720、1440min后均明顯出現(xiàn)了一條66KD的蛋白譜帶，而且表達(dá)水平很高，在噴后540min時(shí)表達(dá)量開始下降，到720min與1440min時(shí)同樣的分子量的蛋

10、白譜帶則變的不是很明顯。在上樣液中加入EGTA時(shí)，幾乎完全阻止了蛋白的表達(dá)量，而加入Ca2+則增加了蛋白質(zhì)的表達(dá)量。為了進(jìn)一步檢測(cè)該蛋白激酶活性的變化，通過放射自顯影法證明，在66KD蛋白譜帶的相應(yīng)部位將凝膠中鑲嵌的底物HIS-Ⅲ進(jìn)行了磷酸化，又由于鈣依賴蛋白激酶家族分子量約為40-90KD,因此推斷該蛋白激酶為鈣依賴蛋白激酶家族。 7.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、HHT、HHT+EGTA處理幼苗，研究