蕈樣肉芽腫T細(xì)胞抗原受體γ基因重排研究.pdf

1、背景：蕈樣肉芽腫(MF)是最常見(jiàn)的原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)，其特征為輔助T細(xì)胞增生，Langerhans細(xì)胞和交指狀網(wǎng)狀細(xì)胞也參與病變。病變呈慢性漸進(jìn)性，初起為多種形態(tài)的紅斑和浸潤(rùn)性損害，以后發(fā)展成腫瘤，晚期可累及淋巴結(jié)和內(nèi)臟。其早期表現(xiàn)可多種多樣，病理上早期診斷尤其困難，多需要反復(fù)的活組織檢查，有時(shí)要待病情進(jìn)一步發(fā)展才能確診。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)MF皮損中T細(xì)胞分化抗原雖可作為輔助手段，但多難以確定皮損的良惡性。因而MF的早

2、期診斷及治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)需要一種新方法的出現(xiàn)。而分子生物學(xué)的進(jìn)展，尤其是T細(xì)胞克隆的檢測(cè)對(duì)于一些早期CTCL的診斷和判斷預(yù)后具有重要意義。 淋巴細(xì)胞惡性增殖的主要特點(diǎn)是克隆性增殖，在T細(xì)胞淋巴瘤表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞的單克隆性基因重排，而絕大多數(shù)炎癥及反應(yīng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)性疾病中則是表現(xiàn)為多克隆性的基因重排。基于此原理，自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，國(guó)外學(xué)者應(yīng)用Southern雜交技術(shù)(SBA)檢測(cè)TCR-β基因重排，或聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)檢測(cè)

3、TCR-γ基因重排，但由于SBA需要新鮮的標(biāo)本，且腫瘤細(xì)胞的數(shù)量占總被檢查數(shù)量的1％-5％才能檢測(cè)出，費(fèi)力、耗時(shí)、且具有放射性，故目前已逐漸被PCR技術(shù)所取代。PCR可用來(lái)檢測(cè)TCR中β、δ、γ鏈，雖大多數(shù)成熟的T細(xì)胞不表達(dá)TCRγ蛋白，但T細(xì)胞中一般完整保留了重排TCR的γ基因；另TCR的γ基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，便于設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，故而在TCR的克隆性分析中常選用TCR的γ基因作為分析對(duì)象，而不是β、δ鏈。目前國(guó)外采用的技術(shù)主要有聚合

4、酶鏈反應(yīng)(PCR)/瓊脂糖凝膠電泳、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCK)/變性梯度凝膠電泳(DGGE)、聚合酶鏈反應(yīng)(pCR)/溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(SSCP)。 國(guó)內(nèi)于上世紀(jì)九十年代中期亦開(kāi)展了一些類似的研究，由于引物的數(shù)量和設(shè)計(jì)以及PCR產(chǎn)物檢測(cè)手段的不同，這些研究顯示MF的TCR-γ單克隆基因重排陽(yáng)性率在52％-90％之間。但實(shí)驗(yàn)中

5、人們發(fā)現(xiàn)在部分炎癥性皮膚病，例如濕疹、神經(jīng)性皮炎、副銀屑病等中亦可檢測(cè)出一定比例的TCR-γ基因單克隆重排陽(yáng)性率。目前該研究仍處在進(jìn)一步探討之中，以期開(kāi)拓一種有較好臨床應(yīng)用前景的基因診斷方法。因而本課題進(jìn)行蕈樣肉芽腫TCR-γ基因重排研究，從而尋找一種更為可靠的MF及相關(guān)疾病的診斷和鑒別診斷方法，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義和科研及臨床應(yīng)用價(jià)值。 目的：探討TCR-γ基因重排在MF診斷中的意義，尋找一種較為敏感的基因診斷方法。 材

6、料和方法：(1)、選取山東省皮膚病性病防治研究所病理科1992年～2006年間經(jīng)臨床和組織病理學(xué)確診的MF病人30例，標(biāo)本為10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織，其中皮損33份，淋巴結(jié)2份。另有15例炎癥性皮膚病患者提供的15份皮損標(biāo)本。(2)、采用TCR-γ基因的Vγ8、Vγ9、、Vγ10、Vγ11、Jγ1-2引物，利用PCR-瓊脂糖凝聚電泳方法檢測(cè)共50份標(biāo)本的基因重排情況。(3)、所得數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)組

7、間率的差別進(jìn)行X<'2>檢驗(yàn)，以P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：(1)、30例MF病人的33份皮膚標(biāo)本，共有29份檢測(cè)到TCR-γ基因單克隆性重排的條帶，總陽(yáng)性率為88％。其中16份斑片期皮損中有14份陽(yáng)性(陽(yáng)性率87.5％)，10份斑塊期皮損有8份陽(yáng)性(陽(yáng)性率80％)，7份腫瘤期皮損全部陽(yáng)性(陽(yáng)性率100％)。2份淋巴結(jié)標(biāo)本均顯示TCK-γ基因單克隆性重排的條帶。三例提供不同疹形皮損患者的6份標(biāo)本均檢測(cè)到TCR-γ基因單克

8、隆性重排的條帶，其中一例病人的兩塊不同疹形皮損顯示相同的重排情況。(2)、15例炎癥性疾病皮膚標(biāo)本中，共有5例檢測(cè)到TCR-γ基因單克隆性重排的條帶，陽(yáng)性率為33％。 結(jié)論：MF組和炎癥性疾病組檢測(cè)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故而TCR-γ基因重排檢測(cè)可以應(yīng)用于MF的診斷與鑒別診斷。但判斷結(jié)果時(shí)要綜合臨床、組織病理、免疫表型、實(shí)驗(yàn)方法等多種因素，故目前只能作為一種輔助診斷方法。另PCR一瓊脂糖凝聚電泳敏感度偏高，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，不太適