五龍鵝IGF-I cDNA及5’非翻譯區(qū)的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、胰島素樣生長因子-Ⅰ(Insulin-like Growth Factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是胰島素樣生長因子的重要成員，對(duì)機(jī)體的生長發(fā)育、組織修復(fù)、營養(yǎng)代謝、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞分化等方面有重要的生物學(xué)作用。本試驗(yàn)以五龍鵝為研究對(duì)象，克隆了IGF-Ⅰ基因cDNA和5’非翻譯區(qū)部分序列，分析了序列的結(jié)構(gòu)、同源性及蛋白的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)IGF-Ⅰ進(jìn)行了原核表達(dá)，并檢測了IGF-Ⅰ基因在五龍鵝10種組織中的表達(dá)情況。將為進(jìn)一步研究IGF-Ⅰ基因的結(jié)

2、構(gòu)與功能、 IGF-Ⅰ基因?qū)ξ妪堸Z生長發(fā)育的調(diào)控以及其與生產(chǎn)性能、經(jīng)濟(jì)性狀之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。結(jié)果如下： 1.根據(jù)雞(M32791)、鴨(AB061721)等的IGF-Ⅰ基因保守序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用RT-PCR法從五龍鵝肝臟總RNA中克隆了562bp的IGF-Ⅰ基因cDNA部分序列(GenBank登錄號(hào)為DQ662932)，其中包括462bp的完整編碼區(qū)。五龍鵝IGF-Ⅰ基因編碼153個(gè)氨基酸，成熟肽分子量為7743.8 Da

3、ltons，等電點(diǎn)pI為7.78；在第36～39個(gè)氨基酸處存在一個(gè)較強(qiáng)的疏水區(qū)；在第37～116個(gè)氨基酸處存在一個(gè)蛋白質(zhì)超家族；56.5％的IGF-Ⅰ蛋白可能存在于細(xì)胞核；蛋白的空間結(jié)構(gòu)主要有3個(gè)α螺旋組成。序列與鴨、雞、火雞、鴕鳥、鵪鶉的氨基酸同源性分別為100.0％、99.3％、98％、99.3％、98.7％，進(jìn)化關(guān)系與鴨最近。 2.根據(jù)雞的序列(M74176)，并參照Kansaku發(fā)表的鴨的5’非翻譯區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物，從

4、五龍鵝基因組DNA中克隆了796bp的5’非翻譯區(qū)部分序列(GenBank登錄號(hào)為DQ988932)。獲得的序列與鴨相比有4處堿基缺失和7處堿基插入，同源性為98.1％；與雞相比有4處破基缺失和3處堿基插入，同源性為93.0％；共有5種常見的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)9處。 3.根據(jù)已測得的五龍鵝IGF-Ⅰ基因的序列(DQ662932)設(shè)計(jì)引物，克隆了表達(dá)IGF-Ⅰ基因成熟蛋白部分的IGF-Ⅰ m序列228bp。將此片段插入到pET

5、-32a質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-IGF-Ⅰ m，經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后，轉(zhuǎn)化E coli.BL21，經(jīng)1.0mM IPTG 25℃誘導(dǎo)4h，目的基因的表達(dá)量較高。SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量約為28KD， Western印跡試驗(yàn)進(jìn)一步表明，表達(dá)的蛋白為目的蛋白。 4.根據(jù)已測得的五龍鵝IGF-Ⅰ基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，提取五龍鵝心、脾、肝、肺、腎、胸肌、腿肌、睪丸、脂肪、腦10種組織的總RNA，建立了利用Re