共刺激分子B7-H3在肝細胞癌的表達及相關(guān)機制研究.pdf

1、研究目的:闡明肝細胞癌組織表達共刺激分子B7-H3的特點及與患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，探討B(tài)7-H3分子對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響及其機制。
　　研究方法:
　　1.通過免疫組化檢測116例肝癌患者組織B7-H3的表達水平和特點，并比較不同分組間B7-H3的表達差異。通過Kaplan-Meier生存分析比較不同B7-H3表達水平患者總體預(yù)后的差異并采用Cox風險模型進行預(yù)后因素分析。
　　2.構(gòu)建B7-H3-shRNA

2、沉默質(zhì)粒，下調(diào)肝癌細胞系HepG2和SMMC7721的B7-H3基因表達，通過MTT實驗和ELISA凋亡試劑盒檢測細胞增殖能力和凋亡水平變化，通過劃痕實驗檢測細胞平面運動能力變化，通過transwell實驗檢測對細胞侵襲能力的影響。
　　3.通過Western blot實驗檢測沉默B7-H3基因后侵襲相關(guān)分子MMP-2、MMP-9，EMT相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin，以及JAK/Stat信號

3、通路分子p-stat3、p-JAK2和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug和Snail的表達變化。
　　4.通過免疫組織化學(xué)方法檢測CD68陽性腫瘤浸潤巨噬細胞在116例肝癌患者組織中的分布及特點，分析TAMs浸潤數(shù)量與B7-H3表達的相關(guān)性，以及TAMs數(shù)量與預(yù)后的關(guān)系。
　　5.分別將HepG2細胞與PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞采用接觸共育和非接觸共育培養(yǎng)，通過RT-PCR和western blot實驗檢測M1型巨噬細胞特征性分子H

4、LA-DR、iNOS和TNF-α，以及M2型分子Arg1、VEGF和CCL22的表達。
　　6.在接觸共育培養(yǎng)體系中，采用B7-H3-shRNA沉默質(zhì)粒下調(diào)HepG2細胞B7-H3基因表達，通過RT-PCR和western blot實驗檢測M1型分子HLA-DR、iNOS和TNF-α，M2型分子Arg1、VEGF和CCL22的表達。并進一步通過加入外源重組B7-H3蛋白，觀察是否可逆轉(zhuǎn)沉默B7-H3對巨噬細胞極化的影響。
　

5、　研究結(jié)果:
　　1.116例肝癌組織標本中，109例可檢測到強弱不等的B7-H3表達。B7-H3的表達水平在不同TNM分期及按是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，組間有顯著性差異。生存分析提示B7-H3低表達組有更高的生存率，B7-H3高表達提示預(yù)后不良。
　　2.采用B7-H3-shRNA沉默質(zhì)粒下調(diào)HepG2和SMMC7721細胞B7-H3基因表達后:1）細胞增殖和凋亡水平無明顯變化;2）平面移行能力和侵襲能力顯著下降;3）EMT

6、機制受到抑制，表現(xiàn)為E-鈣粘蛋白表達升高，而波形蛋白、N-鈣粘蛋白表達下降;4）MMP-2、MMP-9的表達水平和活性下降;5）p-star3和p-JAK2及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達下調(diào)。
　　3.116例肝癌組織標本中，94.8％可檢測到以CD68為標志的TAMs浸潤，顯著高于癌旁和正常肝組織，且浸潤水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。B7-H3的表達水平和TAMs的浸潤數(shù)量呈顯著正相關(guān)。
　　6.采用非接

7、觸共育培養(yǎng)和接觸共育培養(yǎng)，HepG2細胞均可誘導(dǎo)THP-1來源的巨噬細胞發(fā)生M2亞型極化，表現(xiàn)為HLA-DR、iNOS和TNF-α表達下降，而Arg1、VEGF和CCL22表達升高，其中接觸共育的誘導(dǎo)作用更為明顯。
　　7.采用B7-H3-shRNA沉默質(zhì)粒下調(diào)B7-H3基因表達可抑制HepG2細胞誘導(dǎo)THP-1來源的巨噬細胞發(fā)生M2亞型極化，而加入外源重組B7-H3蛋白可一定程度逆轉(zhuǎn)siRNA的沉默作用。
　　結(jié)論:

8、>　　1.B7-H3在肝癌組織表達明顯升高，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。
　　2.B7-H3的表達增強了肝癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　3.B7-H3對肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響與通過JAK-2/Stat-3/Slug通路介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制有關(guān)。
　　4.肝癌組織腫瘤相關(guān)巨噬細胞的浸潤水平與疾病進程和預(yù)后密切相關(guān)，且與組織B7-H3的表達呈顯著正相關(guān)。
　　5.肝癌細胞可通過B7-H3誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞