共刺激分子B7-H3在食管癌中的表達(dá)及對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅全球人類健康。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有多元性及復(fù)雜性，認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和尋找治療腫瘤方法成為遏制腫瘤面臨的巨大挑戰(zhàn)。腫瘤免疫療法是繼手術(shù)、化療、放療后第四大有效的抗腫瘤療法。近年來，作為B7免疫球蛋白超家族的新成員，共刺激分子B7-H3在多種腫瘤組織異常高表達(dá)，并與腫瘤的生物學(xué)特性密切相關(guān)，被認(rèn)為可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。
　　目的:
　　本課題旨在通過檢測人食管鱗癌組織、相應(yīng)癌旁正常組織及

2、食管鱗狀上皮不典型增生組織中B7-H3分子的表達(dá)，分析其與患者臨床病理因素以及術(shù)后生存時(shí)間之間的關(guān)系。檢測食管癌細(xì)胞株TE-1、TE-13、Eca-109細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)，并通過靶向干擾B7-H3基因表達(dá)來研究B7-H3對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　1用免疫組織化學(xué)法檢測食管鱗癌組織、癌旁正常組織及食管鱗狀上皮不典型增生組織中B7-H3蛋白的表達(dá)以及CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤程度。
　

3、　2用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)方法檢測食管癌細(xì)胞株TE-1、TE-13、Eca-109中B7-H3的表達(dá)情況。
　　3用RT-PCR、Western Blot等方法檢測B7-H3 siRNA基因沉默后Eca-109細(xì)胞中B7-H3的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　4通過MTT實(shí)驗(yàn)分析沉默B7-H3后食管癌細(xì)胞的增殖活性。
　　5通過劃痕

4、實(shí)驗(yàn)分析沉默B7-H3后食管癌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。
　　6通過Transwell實(shí)驗(yàn)分析沉默B7-H3后食管癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1免疫組化結(jié)果顯示，B7-H3陽性著色主要定位在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。在82例ESCC患者中，B7-H3陽性率為98.8％。癌旁正常組織和食管鱗狀上皮不典型增生組織呈弱表達(dá)或不表達(dá)。食管癌組織中B7-H3表達(dá)水平與患者性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.

5、05）;與患者的年齡、腫瘤浸潤深度、TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著患者腫瘤浸潤深度的增加，B7-H3的表達(dá)水平增加;臨床TNM分期越晚，B7-H3的表達(dá)越高。CD8免疫組化染色結(jié)果顯示，在82例食管癌組織中，CD8+T淋巴細(xì)胞低度浸潤36例，高度浸潤46例，與食管癌組織中B7-H3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P=0.003)。
　　2 RT-PCR結(jié)果顯示B7-H3在食管癌細(xì)胞TE-1(0.382±0.008)、TE-1

6、3(0.399±0.008)、Eca-109(0.428±0.012)中組成性表達(dá)，均屬于中低表達(dá)水平。其中Eca-109細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)略高于其在TE-1、TE-13中的表達(dá)水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3 RT-PCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組(0.5403±0.0129)、轉(zhuǎn)染空載體組(0.5324±0.0072)相比，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA質(zhì)粒48h可以使Eca-109細(xì)胞中B7-H3 mRNA表達(dá)水平(0.1285

7、±0.0017)降低(P＜0.01)。未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空載體組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4 Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA基因48h后，Eca-109細(xì)胞中B7-H3蛋白表達(dá)水平(0.4214±0.0048)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(0.4921±0.0148)及空轉(zhuǎn)染組(0.5006±0.0129)的B7-H3蛋白表達(dá)(P＜0.05)。未轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5 MTT分

8、析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的Eca-109細(xì)胞接種于96孔板24h、48h、72h后，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA的Eca-109細(xì)胞與空轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明B7-H3 siRNA基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖能力無顯著影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組的Eca-109細(xì)胞24h后向劃痕邊緣爬行的速度快，細(xì)胞鋪展迅速，劃痕的寬度明顯變窄，有些細(xì)胞已經(jīng)爬行至劃痕的中央。而轉(zhuǎn)染

9、B7-H3 siRNA的Eca-109細(xì)胞向劃痕邊緣爬行的速度明顯減慢，劃痕缺損處修復(fù)緩慢。經(jīng)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，B7-H3 siRNA轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組相比，劃痕間距明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA后，Eca-109細(xì)胞的平面運(yùn)動(dòng)能力明顯下降。
　　7 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA后，通過人工基底膜的Eca-109細(xì)胞的數(shù)降低了大約50％。與未轉(zhuǎn)染

10、及空轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。可見沉默B7-H3后，Eca-109細(xì)胞的體外侵襲能力明顯減弱。未轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1共刺激分子B7-H3在人食管癌組織中過度高表達(dá)，與腫瘤的進(jìn)展、患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為監(jiān)測食管癌進(jìn)展的重要指標(biāo)。
　　2 B7-H3在食管癌中的表達(dá)與CD8+T淋巴浸潤程度呈負(fù)相關(guān)，可能參與腫瘤的免疫逃逸。
　　3沉默