食管鱗狀細(xì)胞癌差異表達(dá)基因及其臨床意義.pdf

1、1.目的:
　　 食管鱗狀細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。由于缺乏敏感、特異的早期診斷手段,多數(shù)食管癌患者首次確診時(shí)已屬中晚期,盡管包括手術(shù)、化療及放射治療等在內(nèi)的多學(xué)科綜合治療手段近年來取得了明顯的進(jìn)步,中晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后依然很差,5年生存率僅為約10％,而早期食管癌術(shù)后5年生存率超過92.6%。因此,開發(fā)能用于食管癌早期診斷的分子生物學(xué)工具和方法,對(duì)于食管癌預(yù)后的根本性改善具有重要意義。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)食

2、管癌早期診斷的分子標(biāo)志物做了大量有益的研究,但是食管癌發(fā)生的機(jī)制尚未闡明,食管癌特異性基因和抗原也尚未發(fā)現(xiàn)。癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多階段的生物過程,其中就包括基因表達(dá)譜的改變。了解食管鱗狀細(xì)胞癌的基因表達(dá)模式和食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的重要機(jī)制將有助于我們開發(fā)能夠用于食管癌診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)以及治療的工具,進(jìn)而改善預(yù)后。目前,已開展了一些研究去發(fā)現(xiàn)和鑒定與其發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。然而,到目前而至,尚缺乏對(duì)這些基因表達(dá)譜進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析,而對(duì)

3、基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析將有助于我們洞悉食管鱗狀細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,也將有助于我們開發(fā)能夠早期診斷食管癌、早期檢測(cè)食管癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物。
　　 本研究首先采用DNA芯片技術(shù)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管粘膜上皮組織全基因組基因表達(dá)情況進(jìn)行分析,旨在揭示食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織和正常食管粘膜上皮組織間差異表達(dá)的基因譜,同時(shí)采用生物信息分析技術(shù)推斷這些差異表達(dá)的基因在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用;進(jìn)而,我們

4、從前期研究發(fā)現(xiàn)的在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)明顯上調(diào)的基因中選取CASG3B、IL24,表達(dá)明顯下調(diào)的基因中選取SPINK8和CAB39L,應(yīng)用Western-blot方法和免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)它們?cè)谑彻荀[狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá),探討它們與食管鱗狀細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　 2.資料與方法
　　 2.1患者和樣品
　　 45例人食管鱗癌組織標(biāo)本均來源于河南省腫瘤醫(yī)院2008年7月-2008年11月手術(shù)切除的食管鱗

5、狀細(xì)胞癌患者。其中,男性31例,女性14例。年齡47-75歲,平均年齡為62.4歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。均在河南省腫瘤醫(yī)院接受外科治療。術(shù)前所有患者均簽署知情同意書。術(shù)前均未接受放化療。該研究計(jì)劃方案經(jīng)過鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)術(shù)委員會(huì)批準(zhǔn)。所有食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷均得到至少兩個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師出具的組織學(xué)診斷。依據(jù)UICC第7版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行食管癌分期。
　　 原發(fā)腫瘤組織和正常食管粘膜上皮組織(距腫瘤邊緣大

6、于5cm),在離體后立即置入RNALater液中保存,并移入-80℃深低溫冰箱中保存。
　　 2.2 RNA提取和基因芯片分析
　　 首先,對(duì)其中4例患者原發(fā)腫瘤組織和正常食管粘膜上皮組織進(jìn)行基因芯片分析。
　　 采用TRIzol試劑,按照廠家建議的步驟進(jìn)行全RNA提取;然后,使用分光光度計(jì)進(jìn)行定量;cRNA的擴(kuò)增和生物素標(biāo)記使用Illumina Total PrepRNA擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行(Ambion,Austi

7、n,TX,USA);過夜反應(yīng),使cDNA在體轉(zhuǎn)錄為cRNA,cRNA產(chǎn)物經(jīng)biotin-11-dUTP標(biāo)記;cRNA產(chǎn)量采用分光光度計(jì)定量;然后,提取500ng標(biāo)記的cRNA在包含48000探針的人RefV3珠鏈芯片(Illumina,SanDiego,CA,USA)上,55℃過夜進(jìn)行雜交:隨后使用濃度為1μg/ml的streptavidin-Cy3(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)染色進(jìn)行顯像;采

8、用Illumina公司的the Sentrix BeadChip and BeadStation芯片分析系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)分析。雜交、標(biāo)記、染色、背景噪音及每條芯片上“看家”基因表達(dá)的基礎(chǔ)水平的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均經(jīng)過驗(yàn)證。對(duì)芯片探針掃描后采用Illumina公司的BeadStudio軟件進(jìn)行圖像分析。
　　 2.3差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析
　　 從BeadStudio上獲得的原始豐度數(shù)據(jù)輸入到GeneSpring GX11.0

9、(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)上接受進(jìn)一步分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)以獲得在癌組織和正常食管上皮組織差異表達(dá)水平不少于2倍的探針集合(P＜0.01)。進(jìn)行平均距離法分層聚類分析,基于所有基因的經(jīng)Log值轉(zhuǎn)換的信號(hào)強(qiáng)度值,采用Pearson中心距離度量作為衡量每個(gè)配對(duì)樣本中基因表達(dá)模式相似性的手段。使用GeneSpring GX11.0上的基因本體分析選項(xiàng)檢測(cè)所參與的最顯著的生物學(xué)過程。將Bio

10、PAX通路/網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)換方程輸出到GeneSpring GX。然后,用所發(fā)現(xiàn)的最顯著的細(xì)胞通路工具去確定哪一個(gè)生物學(xué)通路中存在差異表達(dá)基因目錄中基因的富集。在GeneSpring GX軟件上,采用前述方法進(jìn)行基因集合分析。
　　 2.4 SDS-PAGE和Western-blot
　　 從前期研究發(fā)現(xiàn)的在食管鱗狀細(xì)胞癌和正常食管粘膜上皮中表達(dá)明顯上調(diào)的前十位基因中選取分別選取CASG3B、IL24,表達(dá)明顯下調(diào)的前十位基因中

11、選取SPINK8和CAB39L,應(yīng)用Western-blot方法和免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)其在45例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)。
　　 將標(biāo)本稱量后,按照0.1g加入5ml緩沖液的比例加入冰預(yù)冷的PBS,冰浴條件下充分研磨,1000rpm離心5分鐘,收集上清,每100μl分裝一管。然后進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot,用兔抗人多抗來檢測(cè)在不同標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　 每種都用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPI

12、T)作為內(nèi)參照。
　　 方法如下:
　　 SDS-PAGE結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液中,按照同樣的尺寸剪好PVDF膜,先在甲醇中浸泡5秒,與凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中共同孵育10分鐘;
　　 將PVDF膜與凝膠夾在Whatman濾紙中,放入轉(zhuǎn)移電泳槽,穩(wěn)壓200mA,持續(xù)轉(zhuǎn)移4個(gè)小時(shí);
　　 將負(fù)樣的PVDF膜放進(jìn)PBST緩沖液中漂洗5分鐘,然后37℃下用PBST配置的5%BSA封閉30分鐘,每10分鐘晃動(dòng)一

13、次;
　　 用充足的PBST洗膜三次,每次5分鐘,充分吸去未附著的BSA;
　　 用PBST1:2000稀釋兔抗人一抗,37℃孵育60分鐘,每10分鐘晃動(dòng)一次;
　　 用充足的PBST洗膜三次,每次5分鐘,充分吸去未附著的一抗;
　　 用PBST1:200稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗,37℃孵育60分鐘,每10分鐘晃動(dòng)一次;
　　 用充足的PBST洗膜三次,每次5分鐘,充分吸去未附著的二抗;

14、　　 用DAB溶液顯色。
　　 2.5免疫組織化學(xué)(SP法)
　　 常規(guī)石蠟包埋組織,切片厚度5μm,常規(guī)脫蠟、復(fù)水,3%H2O2孵育10分鐘,雙蒸水沖洗后,PBS浸泡5分鐘;
　　 用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù),處理lO分鐘,自然冷卻后PBS沖洗三次,每次三分鐘;
　　 樣品滴加正常山羊血清工作液,37℃孵育20分鐘;
　　 滴加兔抗人多克隆抗體,4℃孵育過夜;
　　 用冰預(yù)冷的0.01M p

15、H7.4的PBS沖洗三次,每次三分鐘;
　　 滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃孵育30分鐘,PBS沖洗三次,每次三分鐘:
　　 滴加SP復(fù)合物,37℃孵育30分鐘,PBS沖洗三次,每次三分鐘;
　　 DAB顯色后,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染后,常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹脂封片。
　　 其他三種抗體檢測(cè)流程同上,并均用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。
　　 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):
　　 經(jīng)抗體染

16、色后,每例切片在光學(xué)顯微鏡下觀察10個(gè)具有代表性的高倍視野,以細(xì)胞漿內(nèi)或核上呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　 數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS13.0進(jìn)行X2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管上皮組織基因表達(dá)的總體差異
　　 采用Illumina HumanRef6V3珠鏈芯片(包含480000個(gè)探針以檢測(cè)人mRNA),我們比較了四例原

17、發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織和配對(duì)正常食管上皮組織的基因表達(dá)譜。經(jīng)過配對(duì)t檢驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)570個(gè)基因(590個(gè)探針集)存在2倍以上的差異表達(dá),這些基因中,303個(gè)基因在癌組織中表達(dá)上調(diào),267個(gè)基因在癌組織中表達(dá)下調(diào)。然后分選后進(jìn)行分層聚類分析,每次比較都是在兩個(gè)大組間進(jìn)行,即下調(diào)的基因組和上調(diào)的基因組,火山圖上分別用綠色和紅色表示。該聚類將食管鱗狀細(xì)胞癌組織集合在一起,將食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管上皮組織區(qū)分開來,而且不同病理分期

18、的食管鱗癌組織中基因差異表達(dá)模式的相似性存在一定差異。
　　 3.2基因本體論分析
　　 所有差異表達(dá)的基因均采用GeneSpring GX11.0軟件上GO選項(xiàng)進(jìn)行分析,產(chǎn)生了17個(gè)明顯的GO產(chǎn)品(校正的P＜0.05)。前5位GO產(chǎn)品分別是:1)細(xì)胞外區(qū)(校正的P=4.48E-11);細(xì)胞外區(qū)部分(校正P=6.08E-08);膠原蛋白(校正P=1.76E-05);細(xì)胞外基質(zhì)(校正P=5.56E-04);肽鏈內(nèi)切酶抑制子

19、活動(dòng)(校正P=0.001229)。在這些GO產(chǎn)品中,我們發(fā)現(xiàn)許多的基因參與基質(zhì)金屬蛋白酶和膠原蛋白活動(dòng)。此外,一些基因參與肽鏈內(nèi)切酶抑制子活動(dòng)。
　　 3.3重要細(xì)胞通路的發(fā)現(xiàn)和基因集合分析
　　 采用發(fā)現(xiàn)的重要細(xì)胞通路和公共細(xì)胞通路數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)7條細(xì)胞通路或細(xì)胞網(wǎng)路與這些差異表達(dá)的基因有密切關(guān)系(P＜0.05):(1)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性(P=0.023);(2)傳導(dǎo)信號(hào)至ERKs(P=D.035);(3)通過NG

20、F進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)(P=0.029);(4)FGF信號(hào)傳導(dǎo)通路(P=0.003);(5)N-cadherin信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)(P=0.035);(6)凋亡中半胱天冬梅瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)(P=0.007);(7)血管生成中的整聯(lián)蛋白(P=9.24E-04)。基因集合分析顯示:包含15個(gè)配對(duì)基因的POD-1_KO_UP基因集合(MIT Broad list C2,P＜0.029)明顯富集。
　　 3.4 Western blot結(jié)果
　　

21、 CASG3B、IL24、SPINK8和CAB39L在正常食管組織和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中均可見表達(dá)。較正常食管粘膜上皮組織相比,CASG3B和IL24在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)上調(diào);SPINK8和CAB391,在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)下調(diào)。這與基因芯片研究結(jié)果相一致。
　　 3.5免疫組化SP法結(jié)果
　　 3.5.1 CASG3B在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)率46.7%(21/45),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率51.

22、9%(14/27)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)率無顯著差異38.9%(7/1.8)(P＞0.05);
　　 3.5.2 IL-24在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)率較高55.6%(25/45),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率70.4%(19/27)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率33.3%(6/18)(P＜0.05);
　　 3.5.3 SPINK8在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)率較高68.9%(31/45),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率55.6%(

23、15/27)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率88.9%(16/18)(P＜0.05);
　　 3.5.4 CAB39L在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)率較低,為13.3%(6/45),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率14.8%(4/27)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)率11.1%(2/18)無顯著差異(P0＞0.05)。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1大量基因通過各種細(xì)胞過程和細(xì)胞通路參與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)生、發(fā)展。
　　 4.2