沙灘馬鞭草提取物對HeLa細胞的生長抑制及誘導凋亡作用的實驗研究.pdf

1、惡性腫瘤是目前危害人體生命和健康的嚴重疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計資料表明，全世界癌癥每年發(fā)病約1000萬人，死亡約700萬人，已成為人類僅次于心血管病的第二殺手。因此探索有效的腫瘤治療方法成為必然。
　　 在惡性腫瘤的治療中，藥物治療占有重要地位。在合成的化學類抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)是以天然抗腫瘤活性成分為先導的化合物。因而，從天然植物成分中，篩選能夠引起細胞凋亡，抑制細胞生長的藥物，將是今后抗腫瘤治療最理想的途徑。<

2、br>　　 沙灘馬鞭草是原產(chǎn)于巴拉圭的多年生藥用植物。目前有關(guān)沙灘馬鞭草藥理活性的研究主要集中在對神經(jīng)生長因子（NGF）的增強作用方面，還未見沙灘馬鞭草及其提取物有抗腫瘤活性的報道。
　　 本研究對從沙灘馬鞭草中提取的16個單一成分的抗腫瘤活性進行了初步篩查，并對其中抗腫瘤活性較強的16＃成分的抗腫瘤機制進行了初步探討。
　　 宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。為此，我

3、們選擇了HeLa細胞（人宮頸癌細胞）為研究對象，觀察沙灘馬鞭草提取物對其生長的抑制作用，并從細胞凋亡方面來進一步探討沙灘馬鞭草提取物誘導細胞凋亡的機理。
　　 材料與方法：
　　 一、細胞培養(yǎng)：
　　 將HeLa細胞接種于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中，2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。
　　 二、沙灘馬鞭草提取物的制備
　　 單體化合物編號

4、1-16，由沈陽藥科大學提供，從沙灘馬鞭草Verbena，littoralisH.B.K.的甲醇提取物中利用硅膠吸附柱色譜、SephadexLH-20柱色譜和半制備型HPLC等方法分離得到，通過理化常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)分析（EI-MS、1HNMR、13CNMR、HMQC和HMBC）鑒定其結(jié)構(gòu)。每個單體化合物經(jīng)DMSO溶解制成儲備液，4℃避光保存。
　　 三、MTT法檢測沙灘馬鞭草提取物對腫瘤細胞的生長抑制作用
　　 1、沙灘馬

5、鞭草16種提取物抗腫瘤活性的篩查
　　 采用MTT的方法，選用大腸癌細胞系CloneA對沙灘馬鞭草16種提取物的生物學活性進行篩查。
　　 2、16?；衔飳Σ煌[瘤細胞系的生長抑制作用
　　 采用MTT的方法，用篩選到的有生物學活性的化合物對不同腫瘤細胞系進行作用，觀察其對不同腫瘤細胞的生長抑制作用是否存在選擇性。
　　 四、16＃化合物對HeLa細胞的生長抑制和誘導凋亡作用
　　 1、16?；?/p>

6、合物對HeLa細胞系的生長抑制作用
　　 我們以生長抑制作用最為明顯的HeLa細胞作為研究對象，采用不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h后，觀察其生長抑制作用。
　　 2、16＃化合物對HeLa細胞作用后的細胞形態(tài)變化觀察
　　 不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h，相差顯微鏡下對形態(tài)進行觀察；不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h，熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。
　　 3、流式細胞術(shù)

7、檢測16＃化合物對HeLa細胞的誘導凋亡作用
　　 不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h，采用Annexin-v/PI凋亡檢測試劑盒進行凋亡率的測定。
　　 4、凝膠電泳檢測16?；衔飳eLa細胞作用的DNA片段化
　　 分別用10、20μmol的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h，收集細胞、提取全基因組DNA，經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測其基因組DNA變化。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一

8、、沙灘馬鞭草提取物的篩選與生物活性的鑒定
　　 1、沙灘馬鞭草16種提取物抗腫瘤活性的篩查
　　 沙灘馬鞭草16種提取物中的第16?；衔飳loneA細胞的生長抑制作用最為顯著，說明16?；衔锸强鼓[瘤作用的有效成分。
　　 2、16?；衔飳Σ煌[瘤細胞系的生長抑制作用
　　 采用MTT的方法，用篩選到的有生物學活性的16?；衔飳Σ煌[瘤細胞系進行作用，發(fā)現(xiàn)16?；衔飳Σ煌哪[瘤細胞均具有生長抑制

9、作用。
　　 二、16?；衔飳eLa細胞的生長抑制和誘導凋亡作用
　　 1、16?；衔飳eLa細胞系的生長抑制作用
　　 16?；衔飳eLa細胞的生長具有明顯的抑制作用。且隨藥物濃度的增加，HeLa細胞的生長抑制率也逐漸增高。
　　 2、16?；衔镒饔脤m頸癌HeLa細胞后的形態(tài)學變化
　　 不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h后，相差顯微鏡下對其形態(tài)進行觀察可見：細胞變圓、體

10、積變小、細胞間隔稍增大，并可見凋亡小體。
　　 不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細胞24h后，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察可見明顯的凋亡小體。
　　 3、流式細胞術(shù)檢測16?；衔飳eLa細胞的誘導凋亡作用
　　 采用Annexin-PI雙染標定后。經(jīng)流式細胞儀檢測可見，16?；衔锟梢哉T導HeLa細胞凋亡，并且具有濃度依賴性。
　　 4、凝膠電泳檢測16?；衔飳eLa細胞作用的DNA片段化