樺褐孔菌提取物抑制人胃癌BGC-823細胞株增殖及誘導(dǎo)凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：在體外實驗中，觀察樺褐孔菌提取物對人胃癌BGC-823細胞株的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用及凋亡相關(guān)基因表達的影響，為其成為防治腫瘤的菌類藥物提供實驗依據(jù)。 方法：選用人胃癌BGC-823細胞株進行體外培養(yǎng)，用MTT比色法測定不同方法提取的樺褐孔菌提取物對胃癌BGC-823細胞株的抗增殖作用。應(yīng)用倒置顯微鏡、HE染色光學(xué)顯微鏡、吖啶橙-溴化乙錠(AO/EB)雙染色熒光顯微鏡及透射電鏡技術(shù)觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。通過脫氧核甘酸末端轉(zhuǎn)

2、移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TUNEL)和AO/EB雙染色法檢測細胞凋亡率。應(yīng)用流式細胞術(shù)進行定量并作細胞周期分析。采用免疫細胞化學(xué)染色法檢測藥物處理前后Ki-67抗原及凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物bax，bcl-2，caspase-3，caspase-9蛋白的表達。 結(jié)果：1)MTT實驗結(jié)果表明：樺褐孔菌的水提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物在10μg/ml～80μg/ml范圍內(nèi)，于12h、24h、48h、72h對胃癌BGC-823細胞株

3、均有抑制生長作用，并表現(xiàn)出濃度、時間依賴性關(guān)系，上述提取物在終濃度80μg/ml、于48h時，體外最大抑制率分別達到51％、62％、60％，樺褐孔菌的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物對人胃癌BGC-823細胞株生長抑制作用高于水提取物。2)HE染色光鏡下，實驗組BGC-823腫瘤細胞體積變小、變圓，核染色質(zhì)濃縮或染色質(zhì)塊形成，有的細胞膜起泡形成凋亡小體；倒置顯微鏡下，實驗組BGC-823腫瘤細胞體積變小、變圓，核染色質(zhì)凝集，細胞間連接疏松，

4、貼壁能力減弱；AO/EB雙染色熒光顯微鏡下，實驗組BGC-823腫瘤細胞胞核染色質(zhì)呈橘紅色，胞質(zhì)內(nèi)的橘紅色或橘黃色熒光消失，細胞周圍可見亮綠色熒光的凋亡小體；透射電鏡觀察，80μg/ml樺褐孔菌水提取物處理后的凋亡腫瘤細胞核染色質(zhì)固縮、邊集，胞質(zhì)內(nèi)有空泡出現(xiàn)，還可見凋亡小體凸出細胞表面。3)AO/EB雙染色細胞凋亡半定量方法結(jié)果，80μg/ml樺褐孔菌水提取物作用BGC-823胃癌細胞12h、24h、48h、72h，凋亡率分別為3.5％

5、、10％、25％、15％，不同時間段相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01或p＜0.05)。TUNEL染色法結(jié)果，當樺褐孔菌水提取物終濃度10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml時，細胞凋亡指數(shù)(AI)依次升高，分別為6.57±0.92％、12.55±1.48％、18.96±2.28％、26.35±1.83％，不同濃度之間相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。4)流式細胞儀檢測，對照組細胞培養(yǎng)48h時，凋亡率僅0.16％，未見

6、亞二倍體峰；當20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml樺褐孔菌水提取物處理48h時，細胞出現(xiàn)了凋亡峰，凋亡率為11.57％、20.97％、31.22％，不同濃度之間相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)，樺褐孔菌水提取物終濃度在20μg/ml～80μg/m1時，G0/G1期和G2/M期細胞百分比下降，S期細胞百分比上升，阻滯周期于S期。5)免疫細胞化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌水提取物處理后，下調(diào)bcl-2基因蛋白的表達，上調(diào)bax，casp

7、ase-3，caspase-9基因蛋白的表達，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。Ki-67抗原檢測結(jié)果，Ki-67的陽性表達率隨藥物濃度的提高和作用時間的延長而降低。不同濃度藥物在24h、48h均抑制胃癌BGC-823細胞株增殖，表現(xiàn)出濃度、時間依賴性關(guān)系，不同濃度與不同作用時間之間均有顯著性差異(p＜0.01)。 結(jié)論：1)體外實驗中，樺褐孔菌水提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物對人胃癌BGC-823細胞生長有

8、抑制作用，呈一定的量效和時效關(guān)系。樺褐孔菌石油醚提取物、乙酸乙酯提取物對胃癌細胞抑制作用高于水提取物。 2)經(jīng)凋亡形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及流式細胞儀結(jié)果分析，樺褐孔菌水提取物作用于人胃癌BGC-823細胞株后均出現(xiàn)腫瘤細胞的凋亡現(xiàn)象。 3)樺褐孔菌水提取物通過干擾細胞周期抑制人胃癌BGC-823細胞的生長，主要阻滯周期于S期。抑制腫瘤細胞增殖可能是樺褐孔菌水提取物抗胃癌作用的機制之一。 4)樺褐孔菌水提取物可能通過下調(diào)