天花粉蛋白抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、天花粉作為一種傳統(tǒng)的中草藥，在我國(guó)入藥歷史悠久，主要應(yīng)用于引產(chǎn)。上世紀(jì)80年代，天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)被證實(shí)為藥物的有效成分。天花粉蛋白，是一種單鏈的核糖體失活蛋白，含247個(gè)氨基酸殘基，通過N-糖苷酶活性使真核細(xì)胞的核糖體失活。一直以來，天花粉蛋白在臨床上主要應(yīng)用于中期引流和治療異位妊娠、胎盤殘留以及滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，天花粉蛋白具有多種藥理學(xué)活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗HIV。為此，天花粉蛋

2、白已受到廣泛的關(guān)注。 本研究將特別關(guān)注天花粉蛋白的抗腫瘤活性及其機(jī)制。天花粉蛋白對(duì)多種腫瘤有抗癌活性，如絨毛膜細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌，以及其他消化道腫瘤等。最初的研究發(fā)現(xiàn)，天花粉蛋白對(duì)絨毛癌JAR細(xì)胞的損傷作用，在于其對(duì)細(xì)胞核糖體有特異的損傷作用。隨后又發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白可以通過誘導(dǎo)JAR細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗癌作用。由此可見，天花粉蛋白目前的抗癌作用研究主要集中在絨毛膜細(xì)胞癌和消化道腫瘤上，而有關(guān)它對(duì)其它腫瘤細(xì)胞作用的研究報(bào)導(dǎo)尚不多見。而且

3、有關(guān)天花粉蛋白的抗癌機(jī)制尚不確定。為此，我們選擇了HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)為研究對(duì)象，觀察天花粉蛋白對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，并且從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩個(gè)方面來研究天花粉蛋白抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，并進(jìn)一步探討天花粉蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理。 細(xì)胞的增值、凋亡、分化和衰老均是細(xì)胞周期依賴性的，所以，從天然藥物中，特別是中草藥，篩選能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，并且引起細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，將是今后抗腫瘤治療最理想的途徑。本實(shí)驗(yàn)在

4、藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)作用研究的基礎(chǔ)上，首次研究了天花粉蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯的作用，并進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，為天花粉蛋白在腫瘤防治中的應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為天花粉蛋白的抗癌機(jī)制提供新的研究途徑。 研究目的 研究天花粉蛋白對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩個(gè)方面來考察細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的機(jī)制，并進(jìn)一步探討天花粉蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制。 研究方法 采用CCK-

5、8的方法，檢測(cè)TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)TCS對(duì)細(xì)胞周期的影響；電子顯微鏡和Annexin法觀察TCS對(duì)HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用；應(yīng)用Westernblot和RT-PCR法觀察HeLa細(xì)胞Caspase-3酶原和mRNA的表達(dá)變化；用Caspases活性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)Caspase-3，8，9的活性。 研究結(jié)果 (1)TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、濃度的增加，抑制作用明顯

6、加強(qiáng)，呈顯著的時(shí)間和濃度依賴性。HeLa細(xì)胞經(jīng)TCS100μg/ml作用24h，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為31.6±3.92％，而作用48h，細(xì)胞殺傷率達(dá)49.34±4.49％。此外，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度明顯下降，其中TCS作用36h，IC50是191.46μg/ml；TCS作用48h，IC50為101.34μg/ml。(2)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，同一濃度(100μg/ml)TCS作用HeLa細(xì)胞24、36和48h

7、，隨著TCS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，S期細(xì)胞比例也隨之增高，G2/M期細(xì)胞所占比例相應(yīng)減少；不同濃度的TCS作用HeLa細(xì)胞48h，發(fā)現(xiàn)50、100μg/mlTCS作用后，S期細(xì)胞比例明顯增加，而G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。(3)100μg/mlTCS作用HeLa細(xì)胞24h后，細(xì)胞膜表面的微絨毛減少，細(xì)胞核固縮變形，染色質(zhì)濃縮成塊狀，邊集于核膜。TCS作用48h后，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征——微絨毛基本消失，胞膜發(fā)泡，并可見凋亡小體，核

8、染色質(zhì)高度濃縮，核膜消失，出現(xiàn)廣泛的空泡化和一個(gè)非常光滑的表面。(4)同一濃度(100μg/ml)TCS作用HeLa細(xì)胞24、36和48h，細(xì)胞凋亡率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高；不同濃度的TCS作用HeLa細(xì)胞48h，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)濃度依賴性增高的趨勢(shì)。100μg/mlTCS作用48h，HeLa細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高的42.52％。(5)同一濃度(100μg/ml)TCS分別作用HeLa細(xì)胞24、36、48h和不同濃度TCS分

9、別作用HeLa細(xì)胞48h后，Caspase-3酶原蛋白條帶逐漸變細(xì)，經(jīng)圖像分析后發(fā)現(xiàn)，Caspase-3酶原和內(nèi)參照β-actin的光密度積分值之比有減少的趨勢(shì)，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。結(jié)果提示，在TCS誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的過程中，Caspase-3酶原發(fā)生了裂解而被活化。(6)用100μg/ml的TCS分別處理HeLa細(xì)胞12、24、36和48h后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各組Caspase-3mRNA的條帶逐漸變粗，經(jīng)圖像分析可見，各濃

10、度組的Caspase-3mRNA和β-actin光密度積分值之比有隨著濃度增加而增高的趨勢(shì)。(7)比色法檢測(cè)Caspases活性的結(jié)果顯示，Caspase-3，8，9活性均有時(shí)間依賴性增高的趨勢(shì)。100μg/mlTCS處理24h后，Caspase-8的活性最高，且明顯高于對(duì)照組；而同樣濃度處理36h后，Caspase-3的活性開始高于對(duì)照組，至48h達(dá)到高峰(是對(duì)照組的2.8倍)。Caspase-9的活性是在100μg/mlTCS作用3

11、6h后才明顯高于對(duì)照組的，但顯著低于Caspase-3。這些結(jié)果提示，Caspases的激活具有時(shí)間順序，且Caspase-8，9可能參與了Caspase-3的活化過程。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能有二，一是由于TCS可以俘獲S期的HeLa細(xì)胞；二是TCS可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。在TCS誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的過程中，Caspase-3的激活是介導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡的共