抗腫瘤壞死因子抗體對大鼠實驗性葡萄膜炎的治療作用.pdf

1、目的： 由于對人類葡萄膜炎的研究受諸多因素的限制，所以主要通過動物模型進(jìn)行廣泛的研究。目前有多種葡萄膜炎動物模型用于研究，本文應(yīng)用大腸桿菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)對Wistar大鼠進(jìn)行免疫，建立Wistar大鼠內(nèi)毒素性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis，EIU)模型，為葡萄膜炎發(fā)病機制和免疫治療的實驗研究提供工具。近年來，抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis f

2、actor-α，TNF-α)治療廣泛地應(yīng)用于一些自身免疫性疾病，并取得令人矚目的療效。應(yīng)用抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(anti-TNF-α monoclonal antibody，抗TNF-α McAb)阻斷大鼠體內(nèi)的TNF-α，評價其對EIU的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)改變的治療作用，并研究阻斷TNF-α后，大鼠血清和眼組織中TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量的變化，進(jìn)一步探討TNF

3、-α、IL-6和IL-10在EIU發(fā)病中的作用。 方法： 1．內(nèi)毒素性葡萄膜炎動物模型的建立：選用Wistar大鼠15只，分為空白對照組(n=3)和實驗組(n=12)。將LPS溶于滅菌生理鹽水中，使之終濃度為2mg/ml，分別取75μl該溶液注射至實驗組Wistar大鼠的雙后足墊，每只大鼠的注射總量為300μg；對照組大鼠雙后足墊注射等量滅菌生理鹽水。密切隨訪觀察，對大鼠發(fā)病后的臨床表現(xiàn)進(jìn)行臨床評價與記分，并進(jìn)行組織學(xué)分

4、級。 2．抗腫瘤壞死因子抗體對大鼠實驗性葡萄膜炎的治療作用： (1)另選用Wistar大鼠54只，分為空白對照組(6只)，陽性對照組(EIU組，24只)和抗TNF-α McAb治療組(24只)三組；每組又平均分為免疫后4小時、24小時和3天三個時相點觀察。 (2)EIU組大鼠雙后足底部注射LPS免疫誘導(dǎo)EIU，抗TNF-α McAb治療組大鼠于LPS免疫前半小時按1μg/kg體重尾靜脈注射抗TNF-α McAb，

5、空白對照組大鼠雙后足墊注射等量滅菌生理鹽水。 (3)臨床及組織學(xué)檢查：免疫大鼠后每2小時進(jìn)行一次裂隙燈顯微鏡和眼底鏡檢查，詳細(xì)記錄發(fā)病時間及高峰時間，臨床表現(xiàn)和評分，炎癥消退時間。分別于免疫后4小時、24小時和3天從大鼠內(nèi)眥靜脈叢取血后，處理大鼠，取眼球，一眼取眼內(nèi)液，并將兩只大鼠的眼內(nèi)液混合，另一眼常規(guī)做病理切片，光學(xué)顯微鏡觀察并做組織學(xué)分級，評價抗TNF-α McAb對EIU的治療作用；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)檢

6、測血清和眼內(nèi)液中的TNF-α、IL-6和IL-10含量，探討TNF-α、IL-6和IL-10在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展中的可能作用。 3．統(tǒng)計方法：全部數(shù)據(jù)用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計方法包括相關(guān)分析、獨立樣本t檢驗、方差齊性檢驗和F檢驗。進(jìn)行F檢驗后有顯著性差異者(p≤0.05)再進(jìn)行下述檢驗，各組均數(shù)方差具有齊性時，行Least-significant-difference(LSD)檢驗

7、；各組均數(shù)方差不具有齊性時，行Tamhane's T2檢驗。以p≤0.05作為統(tǒng)計學(xué)顯著性差異界值。 結(jié)果： 在實驗組Wistar大鼠中成功地復(fù)制出EIU疾病模型，患病率為100％，均出現(xiàn)典型的葡萄膜炎表現(xiàn)；第4小時有10只大鼠出現(xiàn)虹膜血管擴張，少數(shù)出現(xiàn)前房閃輝和細(xì)胞，之后逐漸加重，于24小時炎癥達(dá)高峰，出現(xiàn)虹膜紋理模糊、后粘連，瞳孔縮小，前房內(nèi)纖維蛋白素樣滲出，瞳孔膜閉，玻璃體混濁，眼底窺不入。隨后這些體征逐漸消退，第

8、7天炎癥基本消退。組織學(xué)主要表現(xiàn)為前房纖維蛋白及炎性細(xì)胞滲出，虹膜血管擴張充血，虹膜腫脹增厚伴有蛋白滲出，前后房及虹膜睫狀體基質(zhì)炎細(xì)胞浸潤滲出，玻璃體腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞聚集。 空白對照組大鼠始終未見有EIU炎癥表現(xiàn)；抗TNFα單克隆抗體治療組Wistar大鼠臨床表現(xiàn)明顯減輕，平均臨床評分及組織學(xué)分級顯著低于EIU組，發(fā)病時間延遲。本實驗未發(fā)現(xiàn)抗TNF-α抗體治療組大鼠出現(xiàn)不良反應(yīng)。 血清和眼內(nèi)液TNF-α分別為51.03±

9、9.59 pg/ml和26.8pg/ml。在炎癥早期EIU組大鼠血清TNF-α濃度(212.76±64.26 pg/ml)明顯高于空白對照組，抗TNF-αMcAb治療組濃度下降至空白對照組水平；EIU組大鼠眼內(nèi)液TNF-α在4小時、24小時及3天明顯高于空白對照組，抗TNF-α McAb治療組濃度顯著下降?？瞻讓φ战M大鼠血清IL-6濃度為3.23±1.40 pg/ml，眼內(nèi)液中未檢測到IL-6。EIU組血清和眼內(nèi)液IL-6濃度高于空白對

10、照組，治療組血清及眼內(nèi)液IL-6濃度下降，低于EIU組。EIU組血清IL-10濃度在炎癥后期提高，治療組4小時增高更為明顯；眼內(nèi)液IL-10也有增高趨勢。眼內(nèi)液TNF-α在三個不同的時相點均高于血清水平，眼內(nèi)液IL-10在3天高于血清水平。血清IL-6和眼內(nèi)液IL-6均與眼部炎癥程度有相關(guān)性(r=0.777，p<0.01；r=0.678，p<0.01)；眼內(nèi)液TNF與眼部炎癥程度也存在正相關(guān)(r=0.607，p<0.01)。血清TNF和

11、IL-6之間，眼內(nèi)液TNF-α和IL-6之間存在正相關(guān)(r=0.551，p<0.05：r=0.452，p<0.05)。 結(jié)論：應(yīng)用LPS成功地在Wistar大鼠體內(nèi)建立大鼠EIU動物模型。該模型臨床表現(xiàn)與人類葡萄膜炎相類似，可用于人類葡萄膜炎的發(fā)病機制及免疫治療等相關(guān)研究。該方法簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性好、發(fā)病率高，為進(jìn)一步研究葡萄膜炎的免疫機制，治療及預(yù)防奠定了實驗基礎(chǔ)。 抗TNF-α McAb可以有效地治療EIU，顯著改善

12、EIU癥狀，發(fā)病時間延遲。本實驗進(jìn)一步證實了TNF-α和IL-6在EIU的發(fā)病中起重要作用。眼內(nèi)液TNF-α、IL-6和IL-10高于血清中水平，說明眼內(nèi)自身組織可分泌TNF-α、IL-6和IL-10。IL-10在EIU的病情恢復(fù)中起重要的抗炎作用。本實驗中抗TNF-α抗體可以完全中和血清中的TNF-α。抗TNF-α McAb治療可以降低血清及眼組織內(nèi)TNF-α和IL-6水平，上調(diào)血清IL-10濃度，尤其在炎癥早期，說明抗TNF-α抗體