腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）的表達(dá)、純化及抗腫瘤活性研究.pdf

1、腫瘤的治療是一個相當(dāng)復(fù)雜的問題，治療的策略包括傳統(tǒng)的手術(shù)治療，放療，化療和新近發(fā)展的基因治療。目前傳統(tǒng)的療法治療效果令人不甚滿意，因此需要尋找新的有效治療的思路和手段。利用腫瘤壞死因子治療腫瘤是目前研究的熱點(diǎn)之一。TRAIL即腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡介導(dǎo)配體，它是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(TNF)超家族中的又一成員，能介導(dǎo)許多腫瘤細(xì)胞凋亡，卻不介導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡。由于TRAIL的這一特性使其具有特異性抗腫瘤的可能。本論文就TRAIL在原核和

2、腺病毒系統(tǒng)的表達(dá)、純化及抗腫瘤生物學(xué)活性的測定等方面進(jìn)行了系統(tǒng)詳細(xì)的研究。 首先，從淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出TRAIL全基因及胞外區(qū)基因部分(可溶型TRAIL，sTRAIL)，sTRAIL插入大腸桿菌表達(dá)載體pThioHisA，以硫氧環(huán)蛋白融合蛋白的形式實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。經(jīng)腸激酶切割和親和及離子純化，獲得了較高純度的重組sTRAIL蛋白。 其次，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組機(jī)制構(gòu)建了攜帶TRAIL基因的重組腺病毒基因組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞得到

3、重組腺病毒(Ad-TRAIL)。大量擴(kuò)增，并經(jīng)CsCl超速離心純化以獲得高滴度的重組腺病毒。Westernblot和流式細(xì)胞術(shù)確定該重組腺病毒能在宿主細(xì)胞內(nèi)有效地表達(dá)外源基因，并持續(xù)一定的時間。免疫熒光實(shí)驗證明TRAIL經(jīng)重組腺病毒表達(dá)后定位于細(xì)胞質(zhì)。 最后，為了評價TRAIL對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的抗腫瘤活性和治療價值，選擇了四株NSCLC細(xì)胞株，YTMLC，GLC，A549和H460作為研究對象。通過觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)改

4、變、DANladder、流式細(xì)胞術(shù)分析等來確定腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生凋亡；用生長抑制實(shí)驗來評價腫瘤細(xì)胞存活率，用克隆形成實(shí)驗來評價TRAIL對腫瘤細(xì)胞致瘤性的影響。動物實(shí)驗進(jìn)一步評價了TRAIL抗腫瘤的作用，裸鼠經(jīng)皮下注射YTMLC細(xì)胞，建立肺癌腫瘤模型，注射Ad-TRAIL，sTRAIL后評價腫瘤的生長情況和治療的毒性。體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)TRAIL作用后細(xì)胞存活率下降，致瘤性降低，腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變，凋亡細(xì)胞增加，DNA片段化等。體內(nèi)實(shí)