MicroRNA-125a在胃癌中表達(dá)水平的研究及其臨床意義.pdf

1、背景和目的:
　　胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球全部惡性腫瘤中，胃癌發(fā)病率排在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌后居第四位，而死亡率在肺癌之后居第二位，2008年全球新診斷出的胃癌約990，000例，死亡人數(shù)高達(dá)約738，000。盡管在一些國(guó)家和地區(qū)的發(fā)病率和死亡率有所降低，但包括我國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)發(fā)病率仍較高。我國(guó)每年新確診的患者約40萬(wàn)，胃癌仍然是我國(guó)三大常見(jiàn)惡性腫瘤之一。
　　盡管目前胃癌

2、的治療手段得到了長(zhǎng)足進(jìn)步，除了手術(shù)治療以外，各種輔助放、化療及免疫治療的發(fā)展在一定程度上提高了臨床的治療效果，然而，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者的預(yù)后仍然很差。因此，有部分學(xué)者認(rèn)為，某些基因的存在可能有助于胃癌細(xì)胞向惡性潛能發(fā)生轉(zhuǎn)化，但具體要鑒別究竟哪些基因可以用來(lái)預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后和復(fù)發(fā)仍然需要更加深入的研究。
　　MicroRNA(miRNA)一種成熟的、小的、非編碼的、單鏈、高度保守的內(nèi)源性RNAs，通過(guò)與靶信使RNA(mRNA

3、)3'端的非翻譯區(qū)(3'UTR，untranslated regions)，近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而抑制靶蛋白編碼基因的翻譯及表達(dá)。miRNA在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中首先被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的、初始片段pri-miRNAs，然后經(jīng)過(guò)RNA內(nèi)切酶Ⅲ Drosha剪切等一系列復(fù)雜過(guò)程，生成長(zhǎng)度70 nt的miRNA前體(pre-miRNAs)，最后pre-miRNAs被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，被Dice

4、r酶切割成成熟的miRNA。到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾百種miRNA。在人類的所有基因譜中，大約有30％的miRNAs參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼的各種基因。因此，miRNA具有多種生物學(xué)功能，調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程，參與細(xì)胞的發(fā)育、代謝、分化、增殖、自噬和凋亡等。miRNA與人類腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控研究已發(fā)展成為生物醫(yī)學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有異常的表達(dá)，并且可以發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作

5、用。
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明:miR-125家族在腫瘤組織中存在異常表達(dá)。miR-125家族由miR-125a，miR-125b-1及miR-125b-2組成，miR-125a位于染色體19q13上，有miR-125a-3p和miR-125a-5p兩種成熟體，分別來(lái)自miR-125a前體的3'端和5'端。miR-125家族在很多實(shí)體腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能。因靶基因的不同，miR-125a的表達(dá)水平不一致。在多種實(shí)體腫瘤中檢測(cè)到mi

6、R-125a的表達(dá)減少，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p的表達(dá)降低與胃癌發(fā)展?jié)撃芟嚓P(guān)。此外，也有報(bào)道稱被研究者普遍忽視的miR-125a-3p，在胃癌病變中與miR-125a-5p有著幾乎相同的功能。除此之外，也有報(bào)道指出，在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-125a的編碼區(qū)域發(fā)生突變可減少的miR-125a的表達(dá)，以上這些結(jié)果提示miR-125a的-5p和-3p可以作為抑癌基因，并下調(diào)miR-125a的表

7、達(dá)，因此可能用作胃癌診斷和治療的基因遺傳標(biāo)記。
　　在乳腺癌中，miR-125a的編碼區(qū)域發(fā)生突變可下調(diào)miR-125a的表達(dá)，那么miR-125a的編碼區(qū)域在胃癌中是否也發(fā)生了突變？這種突變是否也能導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)？具體的分子機(jī)制如何？基于對(duì)以上問(wèn)題的思考，在本研究中，我們首先檢測(cè)了miR-125a-5p和-3p在人胃腺癌細(xì)胞系（MGC-803和BGC-823）以及胃癌組織與其鄰近的正常胃組織表達(dá)水平。然后，我們對(duì)胃癌患者和健康志

8、愿者（對(duì)照組）的miR-125a的編碼區(qū)域進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)pri-miR-125a種系突變與胃癌發(fā)生和miR-125a的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，這些結(jié)果表明miR-125a是胃癌的抑癌基因。
　　方法:
　　1.收集胃癌患者的臨床組織標(biāo)本。自2012年4月至2013年1月期間，我們共收集了山東省淄博市中心醫(yī)院75對(duì)經(jīng)病理證實(shí)的胃癌組織標(biāo)本和距離癌灶5cm以上的癌旁組織標(biāo)本（經(jīng)HE染色證實(shí)）。所有患者均未接受過(guò)化療、放療或者其他治療。

9、手術(shù)獲取的新鮮組織標(biāo)本于20min內(nèi)立即用液氮浸沒(méi)降溫，并置于液氮罐中保存。血液標(biāo)本抽取287名健康漢族志愿者的靜脈血。
　　2.人胃癌細(xì)胞系體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。人胃腺癌細(xì)胞系MGC-803和BGC-823，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　3.通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織miR-125a-5p和miR-125a-3p的表

10、達(dá)水平。RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。單鏈cDNA的合成采用MicroRNA Reverse Transcription試劑盒。按照TAKARA公司的熒光定量試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
　　4.DNA的收集和基因分型。胃癌組織和癌旁組織DNA的提取及血液樣本的DNA提取采用TIANamp血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒。DNA樣本使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物應(yīng)

11、用ABI公司的3730 xl測(cè)序平臺(tái)正向測(cè)序。使用軟件DNAMAN和Chromas Lite對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。用于miR-125a的PCR測(cè)序引物分別為:上游5'-TGTGTC TCT TTC ACA GTG GAT C-3'和下游5'-CCA TCG TGT GGG TCT CAA G-3'。
　　5.MiRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。在RNAfold網(wǎng)站操作獲得對(duì)217個(gè)bp的pri-miR-125a二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中包括對(duì)突變位點(diǎn)的預(yù)

12、測(cè)。
　　6.MiR-125a的表達(dá)載體構(gòu)建。為構(gòu)建miR-125a的表達(dá)載體，將1016-nt片段對(duì)應(yīng)pri-miR-125a，和它的側(cè)面區(qū)域（之前確認(rèn)兩個(gè)區(qū)域等位基因）從cDNA克隆到pcDNA3.1載體上。序列產(chǎn)生的兩個(gè)向量經(jīng)過(guò)直接測(cè)序證實(shí)，唯一的區(qū)別是突變位點(diǎn)。引物分別是miR-125a-F/XhoI,5'-CCG CTC GAG GGT AGG AGG TTG TAT AGT TGA GGA GG-3'以及miR-125

13、a-R/XbaI,5'-GCT CTA GAC CTC TGG GCC TCT CCT GC-3'。
　　7.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8法）。將MGC-803和BGC-823胃癌細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞，以DMEM培養(yǎng)過(guò)夜。然后用不同類型的miR-125a載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，以pcDNA3.1空載體作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，每孔加入10ul的CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，于450nm處測(cè)定讀取吸光度值。
　　8

14、.雙熒光素酶報(bào)告基因分析。將ERBB2基因3'UTR片段(618bp)克隆插入到pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target載體上。將MGC-803和BGC-823胃癌細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于48孔板，24h后將miR-125a表達(dá)載體及雙熒光素酶載體共同轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞，具體方法按照Invitrogen公司的產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。采用Dual-Luciferase Assaysystem進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)三復(fù)

15、孔，并重復(fù)三次。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩獨(dú)立組間的資料采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料組間差異比較采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.胃癌組織中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表達(dá)均減少。為了探索miR-125a在胃癌發(fā)生中的作用，我們使用RT-qPCR的分析了75對(duì)胃癌組織和癌旁組織mi

16、R-125a的表達(dá)模式，將三例患者的癌組織RNA設(shè)為一組（75對(duì)共分成25組）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:胃癌組織中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表達(dá)水平分別減少了92％(23/25)和80％(20/25)。
　　2.pri-miR-125a編碼區(qū)域發(fā)生種系突變。核苷酸變異可以改變miRNA的表達(dá)，并證實(shí)與多種人類疾病相關(guān)。我們從胃癌組織中提取DNA進(jìn)行pri-miR-125a編碼區(qū)域測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5位患者攜帶G等位基因，存在于

17、miR-125a-5p中+43和pri-miR-125a中+29。此外，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌旁組織（正常胃組織）與胃癌組織的基因型相同。此外，我們對(duì)同一地區(qū)287名健康志愿者的G等位基因進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)攜帶G等位基因的人，在1000genomes數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有找到這種等位基因。既然來(lái)自同一地區(qū)的健康人中沒(méi)有攜帶G等位基因，因此在胃癌患者中G等位基因的存在不太可能是由于奠基者效應(yīng)所致。上述這些結(jié)果表明，突變的pri-miR-125a可能與胃癌的

18、發(fā)生有關(guān)。
　　3.G變異可以增加pri-miR-125a穩(wěn)定性并下調(diào)miR-125a的表達(dá)。為了研究這種突變的功能，我們首先比較了變異及未變異pri-miR-125a的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示:G等位基因會(huì)導(dǎo)致在莖環(huán)的大小一個(gè)明顯的變化（從8核苷酸循環(huán)到6核苷酸循環(huán)，從10核苷酸配對(duì)到12核苷酸配對(duì)），△G從-74.30kcal/mol.減少到-77.08kcal/mol。使用RT-qPCR和兩種不同的表達(dá)載體攜帶miR-125a-5

19、p等位基因，我們量化成熟miR-125-5p在兩個(gè)胃癌細(xì)胞MGC-803和BGC-823中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)突變的存在使成熟miR-125-5p表達(dá)水平減少了約40％，這與RT-qPCR的分析結(jié)果相一致。
　　4.miR-125a的表達(dá)下降，從而減弱了miR-125a對(duì)ERBB2的抑制效果及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。ERBB2基因，有報(bào)道認(rèn)為它是miR-125-5p的靶基因，屬于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR/ERBB）家族成員，在許多

20、類型的癌細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)，并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。我們使用了ERBB23'UTR研究突變對(duì)ERBB2基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-125a可減弱ERBB2的表達(dá)，這點(diǎn)在攜帶G基因的細(xì)胞中更加明顯。為研究ERBB2的體內(nèi)表達(dá)情況，我們采用RT-qPCR法檢測(cè)胃癌和癌旁組織（正常胃組織）中ERBB2 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中的ERBB2表達(dá)水平顯著升高。
　　5.基于ERBB2的功能，miR-125a表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。我們采

21、用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，探討不同miR-125a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性的影響。首先獲得不同的pri-miR-125a表達(dá)載體，分別攜帶A、G等位基因;然后將這兩種不同的pri-miR-125a表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入MGC-803和BGC-823胃癌細(xì)胞。正如預(yù)期所料，我們發(fā)現(xiàn)MGC-803胃癌細(xì)胞的增殖受到顯著抑制（與對(duì)照組相比，P=0.0008 vs.P=0.0067），A到G的變異對(duì)細(xì)胞的影響約20％(P=0.023)。攜帶A等位基因的pri-miR

22、-125a也能抑制BGC-823胃癌細(xì)胞的增殖(P=0.0075)，但G變異的影響不大。
　　結(jié)論:
　　1.胃癌組織中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯降低。
　　2.pri-miR-125a編碼區(qū)域發(fā)生了種系突變。
　　3.G變異可以增加pri-miR-125a穩(wěn)定性并減少miR-125a的表達(dá)。
　　4.miR-125a的表達(dá)減少，減弱了miR-125a對(duì)ERB