人類體細胞核移植胚胎紡錘體形態(tài)及其相關蛋白的檢測.pdf

1、研究背景：核有絲分裂器蛋白(Nuclear Mitotic Apparatus Protein， NuMA)、紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein， Eg5)及γ-tubulin在人類成纖維細胞增殖，人類卵母細胞成熟和人類體細胞核移植胚胎早期發(fā)育過程中起重要作用。NuMA是一種分子量為236-240kDa的大分子核蛋白，具有微管聚合作用，能使微管錨定于紡錘體極。Eg5是驅動蛋白家族成員之一，動力蛋白介導運輸并定

2、位NuMA于紡錘體極，通過NuMA遠端指導聚集微管蛋白。γ-tubulin是中心粒周圍物質(Pericentriolar material, PCM)中一種具代表性的蛋白，具有起始微管晶核形成，調節(jié)紡錘體組裝的作用。相關研究證明上述任一種蛋白的缺失或過表達均可導致紡錘體形態(tài)異常，最終導致細胞分裂異常。Simerly等在非人靈長類體細胞核移植實驗中發(fā)現(xiàn)，所檢測的體細胞核移植胚胎中NuMA缺失，驅動蛋白Eg5分布紊亂，紡錘體形態(tài)異常，因此作

3、者認為，非人靈長類體細胞核移植實驗失敗的主要原因是由于卵母細胞去核過程中造成了NuMA及驅動蛋白Eg5損失。后來的研究顯示，大部分猴子體細胞核移植胚胎NuMA分布基本正常。人類不同成熟階段卵母細胞及體細胞核移植胚胎紡錘體及其相關蛋白分布如何?目前還未見相關文獻報道。
　　 目的：為了尋求人類胚胎成纖維細胞、不同成熟階段人類卵母細胞及人類體細胞核移植胚胎紡錘體形態(tài)及其相關蛋白分布規(guī)律，探討人類卵母細胞去核過程中紡錘體及其相關蛋白的

4、損失是否是導致人類體細胞核移植效率低下的原因，以期解決人類體細胞核移植研究面臨的技術難題，加速人類治療性克隆應用的步伐。
　　 方法：使用間接免疫熒光染色方法在普通熒光顯微鏡或激光共聚焦熒光顯微鏡下對人類胚胎成纖維細胞、不同成熟階段人類卵母細胞及人類體細胞核移植胚胎紡錘體及其相關蛋白分布進行觀察。
　　 生發(fā)泡(Gv)期、MⅠ期的人類卵母細胞來源于中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院ICSI患者治療過程中廢棄的卵母細胞；MⅡ期人類

5、卵母細胞大部分來源于ICSI患者治療廢棄的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)，另一部分來源于多囊卵巢(PCOS)患者穿刺治療捐獻的卵母細胞。人類胚胎成纖維細胞來源于人類干細胞國家工程研究中心。使用人類胚胎成纖維細胞為供核細胞，在偏振光顯微鏡下去除MⅡ期人類卵母細胞核，使用內徑為8-10μm的顯微注射針將供核細胞顯微注射于去核的MⅡ期人類卵母細胞胞質內，體外化學激活(A23187聯(lián)合6-DMAP)后對人類體細胞核移植胚胎進行G1.5/G2.5序貫培養(yǎng)。

6、
　　 結果：1、在人類胚胎成纖維細胞分裂間期及人類卵母細胞Gv期，NuMA分布于細胞核內除核仁外的位置，α-tubulin呈網狀分布于細胞質內；人類胚胎成纖維細胞有絲分裂中期及人類卵母細胞MⅠ及MⅡ期，NuMA凝集分布于紡錘體兩極。
　　 2、在人類胚胎成纖維細胞有絲分裂間期，Eg5分布于核質內，γ-tubulin呈一凝集點狀分布于核膜附近：在人類胚胎成纖維細胞有絲分裂中期，Eg5及γ-tubulin均集中分布于紡錘體

7、兩極，Eg5在紡錘體中央區(qū)及細胞質中也有分布。
　　 3、去核后人類卵母細胞胞質未檢測到NuMA及α-tubulin的表達，去除的核胞體中染色后發(fā)現(xiàn)正常規(guī)則的紡錘體，人類卵母細胞染色體整齊排列在赤道板上，NuMA定位在紡錘體兩極。注入供核細胞后2小時（核移植胚胎激活前），供核細胞核出現(xiàn)成熟前染色體凝集，短暫紡錘體結構形成，NuMA聚集于紡錘體兩極。原核形成時期，NuMA分布于除核仁外的核質內，α-tubulin分布于細胞質內；人

8、類體細胞核移植胚胎第一次有絲分裂中期，NuMA主要分布于紡錘體兩極。人類體細胞核移植發(fā)育阻滯胚胎可栓測到NuMA分布在間期細胞核內。
　　 結論：在人類胚胎成纖維細胞分裂間期及人類卵母細胞Gv期NuMA分布于核質內，人類胚胎成纖維細胞分裂中期及人類卵母細胞MⅠ、MⅡ期NuMA分布于紡錘體兩極。在不同發(fā)育階段的人類體細胞核移植胚胎中可檢測到NuMA表達，細胞分裂間期，NuMA分布于核質內，α-tubulin分布于細胞質內，細胞分裂