豬體細(xì)胞核移植及其相關(guān)技術(shù)研究.pdf

1、體細(xì)胞克隆豬在人的動(dòng)物疾病模型和人類異種器官移植方面具有巨大優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力，已經(jīng)成為當(dāng)今體細(xì)胞克隆領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雖然體細(xì)胞克隆豬在幾個(gè)國(guó)家已獲得成功，但其克隆效率仍很低(1-2％)。本研究以建立高效的豬體細(xì)胞核移植技術(shù)體系為目的，系統(tǒng)地研究了影響豬體細(xì)胞核移植效率的因素，通過(guò)優(yōu)化相關(guān)技術(shù)，改善培養(yǎng)條件，達(dá)到穩(wěn)定、大量地生產(chǎn)克隆胚胎，并進(jìn)行胚胎移植以期獲得克隆豬的出生。 本研究利用組織塊法建立了廣西巴馬香豬的40d胎兒成纖維細(xì)胞

2、系、成年耳成纖維細(xì)胞系，以機(jī)械刮取法建立了輸卵管上皮細(xì)胞系，并分離培養(yǎng)了豬卵泡液中的顆粒細(xì)胞，研究了凍存對(duì)胎兒成纖維細(xì)胞的影響以及胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和染色體倍性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凍存后的胎兒成纖維細(xì)胞仍能保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈典型的S型，在傳代10次之前，染色體倍性正常的比例在92％以上。利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pEGFP-c1，研究了細(xì)胞密度、DNA、脂質(zhì)體的用量、DNA脂質(zhì)體復(fù)合物的暴露時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明：

3、24孔板內(nèi)細(xì)胞匯合85％-90％，1.0μg DNA和2.4μL脂質(zhì)體的用量，暴露4h轉(zhuǎn)染效率最高。 優(yōu)化了卵母細(xì)胞體外成熟體系：在NCSU-23+10％PFF中培養(yǎng)的卵母細(xì)胞成熟率最高(79.08％)，F(xiàn)BS對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟作用不大；成熟培養(yǎng)液NCSU-23的成熟培養(yǎng)效果略高于TCM 199；在NCSU-23培養(yǎng)液中添加EGF對(duì)成熟效率影響不大。 經(jīng)多次孤雌激活實(shí)驗(yàn)表明，以200V/mm，60μs，1DC的處理效果最

4、佳；電激活后分別在成熟培養(yǎng)液中添加2mM 6-DMAP進(jìn)行化學(xué)處理，所得的卵裂率略高于對(duì)照組、囊胚率顯著高于對(duì)照組；20μM/L離子霉素激活處理40min激活效果最好；體外成熟培養(yǎng)36h、40h、52h的卵母細(xì)胞在卵裂率和囊胚率上明顯不如44h、48h，成熟培養(yǎng)48h的卵母細(xì)胞卵裂率最高可達(dá)81.75％，44h囊胚率最高為22.22％。 血清饑餓法和接觸抑制法對(duì)供核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期化處理，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期。各組之間的卵裂

5、率、囊胚率差異不顯著，經(jīng)血清饑餓的供體細(xì)胞所得的囊胚率較高。比較了盲吸法、Spindle-view去核法，發(fā)現(xiàn)Spindle-view法的去核率可以達(dá)到95.76％，是一種安全、高效的去核方法。以胎兒成纖維細(xì)胞作為供核體細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚后期發(fā)育效果良好；1.0代以內(nèi)的胎兒成纖維細(xì)胞更有利于重構(gòu)胚的發(fā)育，融合率、卵裂率和囊胚率都很高。200v，60us，1DC電激活后，在以B2為培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)，無(wú)論在重構(gòu)胚的融合率、卵裂率和囊