華南普通野生稻遺傳多樣性研究及NBS-LRR抗性基因發(fā)掘.pdf

1、普通野生稻(Oryza rufipogonGriff.)是亞洲栽培稻（O.sativaL.）育種的重要基因庫源，其豐富的遺傳多樣性蘊藏著大量的抗性變異基因。由于普通野生稻原生境的破壞，其野生居群的數(shù)量和面積正在不斷減少，如何通過遺傳多樣性評估和核心種質(zhì)構(gòu)建來保護這一重要的種質(zhì)資源，以及發(fā)掘該種質(zhì)的抗性基因，對于降低研究周期、成本和擴大水稻基因資源庫具有極其重要的稻屬育種意義。本研究利用野生稻表型特征和SSR標(biāo)記（Simple seque

2、nce repeats），分析了普通野生稻8個居群（東鄉(xiāng)、佛岡、博羅、增城、惠來、高州、遂溪和瓊海）的種質(zhì)資源遺傳多樣性，并構(gòu)建了其核心種質(zhì)，從核心種質(zhì)中選取2份具有優(yōu)異性狀的材料進行全基因組測序，通過全基因組重測序的方法發(fā)掘NBS-LRR類變異基因，研究結(jié)果表明：
　　通過野生稻13個表型質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀的分析，結(jié)果顯示，數(shù)量性狀的平均變異系數(shù)（coefficient of variation）為0.56，其中二次枝梗數(shù)的變異

3、系數(shù)平均為2.46，是表型變異的主要來源；居群間表型變異最大的是博羅居群，最小的是佛岡居群，3個質(zhì)量性狀和原種地緯度具有一定的相關(guān)性。通過分布在栽培稻12條染色體上的36對SSR引物，進行居群間的遺傳多樣性分析，居群的有效位點數(shù)（Effective number of alleles,ne）、Nei's基因多樣性（Nei'sgene diversity,h）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon'sinformation index,I）和多態(tài)性信

4、息量（Polymorphism information content,PIC）平均值分別為1.403、0.239、0.365、0.640，說明普通野生稻具有較高的遺傳多樣性。8個居群中增城、高州和遂溪3個居群的SSR遺傳多樣性較高，東鄉(xiāng)、瓊海和佛岡的次之，惠來和博羅的最低。經(jīng)過遺傳分化和基因流評估顯示，8個野生稻居群之間基因交流較少，增城居群與其它居群差異最大。
　　本研究根據(jù)表型和SSR標(biāo)記遺傳距離構(gòu)建了130份核心種質(zhì)，核心

5、種質(zhì)在不同居群中占總種質(zhì)的12.1~20％。經(jīng)過核心種質(zhì)表型檢驗，發(fā)現(xiàn)核心種質(zhì)與總種質(zhì)間的數(shù)量性狀差異不顯著，質(zhì)量性狀能代表總種質(zhì)的100%。基因型重復(fù)性檢驗顯示全部核心種質(zhì)不存在基因型重復(fù)，構(gòu)建的核心種質(zhì)能有效覆蓋到表型和分子樹狀圖的每一個亞群，且能夠均勻分布于主成分（Principal component analysis）分布圖中。核心種質(zhì)基因保留率在94.20%~98.82%之間，多樣性參數(shù)經(jīng)過T測驗顯示，核心種質(zhì)和原始種質(zhì)遺傳

6、多樣性差異不顯著。說明通過本研究表型和分子數(shù)據(jù)構(gòu)建的普通野生稻核心種質(zhì)具有較好的遺傳代表性和保留了較高的遺傳多樣性。
　　利用Illumina HiSeq2000100PE高通量測序平臺，以日本晴（O.sativaL.，Japonica）和93-11（O.indica,Indica）為參考基因組，從核心種質(zhì)中構(gòu)建兩份普通野生稻純合自交系材料，并進行全基因組重測序研究。通過測序，樣品的堿基覆蓋深度（>=1x）在89.59%以上，平均

7、覆蓋深度大于32.48x。從SNP、InDel的總差異性來看，DXW102的SNP和InDel偏向于日本晴，DXW103偏向于93-11，SNP和InDels變異基因注釋表明，DXW103在日本晴參考基因組注釋的SNP、InDel變異最高，DXW102在日本晴參考基因組的注釋變異最低。兩份材料在93-11和日本晴參考基因組序列注釋的基因分別有53.1%和55.1%相同，說明在兩個參考基因組注釋后，變異基因差異較大。
　　基于基因注

8、釋結(jié)果，本研究篩選出大量的NBS-LRR類候選變異基因。通過PCR驗證發(fā)掘的NBS類基因，發(fā)現(xiàn)研究發(fā)掘的NBS基因準(zhǔn)確性達到了100%。經(jīng)過NBS-LRR類基因家族變異基因的結(jié)構(gòu)分類、染色體定位和同源性分析，表明NBS結(jié)構(gòu)域序列比LRR更為保守穩(wěn)定，兩份材料均顯示11號染色體分布了最多的NBS-LRR類基因；NBS序列多樣性分析顯示，NBS序列間差異范圍為2.565-6.701，且DXW102的NBS序列多樣性高于DXW103。另外，N

9、BS類基因的蛋白互作分析顯示，NBS基因主要與細胞色素C（Cytochrome C）基因之間蛋白互作。該結(jié)果說明，野生稻存在大量的NBS-LRR變異基因，以兩個參考基因組注釋基因的方法具有發(fā)掘更多的NBS變異基因優(yōu)勢。
　　本研究通過普通野生稻遺傳多樣性分析及其核心種質(zhì)的構(gòu)建，從核心種質(zhì)中構(gòu)建了兩份純合自交系材料進行全基因組重測序，發(fā)掘了一批NBS-LRR變異新基因，并對 NBS基因進行結(jié)構(gòu)和功能分析，為水稻育種提供了大量的育種資