花生NBS-LRR家族基因的克隆和功能分析.pdf

1、花生(Arachis hypogaea L.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物與油料作物，我國花生產(chǎn)量占世界花生總產(chǎn)量的45％。其遺傳育種研究一直受到廣泛的重視，在常規(guī)的種質(zhì)資源雜交和系統(tǒng)育種等方法得到了出口型、加工型、油用型、營養(yǎng)型、抗逆型等專用花生新品種選育工作，取得了顯著成就。但是這種常規(guī)育種存在育種周期長，成本高，制約了花生育種進(jìn)展，所以今年來對花生分子生物學(xué)的研究深入，逐漸顯現(xiàn)出了分子育種的優(yōu)越性。其中利用基因工程將外源基因

2、導(dǎo)入花生基因組，是提高花生質(zhì)量的有效方法，有希望進(jìn)一步育成抗蟲抗病的優(yōu)質(zhì)花生新品種。
　　 本文根據(jù)NBS-LRR基因家族的保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增，并通過RACE-PCR(rapid-amplification of cDNA ends)得到全長。構(gòu)建NBS-LRR家族基因的超表達(dá)載體并通過轉(zhuǎn)基因過程轉(zhuǎn)到煙草和花生中進(jìn)一步研究其作用;另外在花生各個品種中通過熒光表達(dá)分析研究NBS-LRR家族基因和抗旱抗病之間的關(guān)系。
　

3、　 RACE-PCR分析結(jié)果顯示，根據(jù)NBS-LRR基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到了中間片段，并得到了兩個NBS-LRR家族基因全長，命名為PnAG1-1和PnAG1-2。PnAG1-2全長確定為1344bp，開放閱讀框?yàn)?098bp，表達(dá)365個氨基酸。PnAG1-1全長1088bp，開放閱讀框?yàn)?41bp，表達(dá)247個氨基酸。其中和苜蓿蒺藜(Medicago truncatula)中的Rps-k-2基因相似度最高，

4、和PnAG1-1和PnAG1-2的相似度分別達(dá)到85％和87％;和大豆(Glycine max)中的At3g14460基因相似度高達(dá)83％和82％。
　　 基因克隆結(jié)果顯示，花生中已知的NBS-LRR基因序列PnAG1和 PnAG3以及相應(yīng)的RNA反義序列序列正確克隆，酶切和測序結(jié)果顯示序列正確連接到PUC19載體和PRi101-AN植物超表達(dá)載體上。
　　 轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示，成功得到了PnAG1和PnAG3的轉(zhuǎn)基因植物，

5、檢測結(jié)果顯示為陽性，表明載體已經(jīng)成功植入煙草的基因組中。
　　 Real-Time PCR分析結(jié)果表明，PnAG1和PnAG3、PnAG1-1的表達(dá)量在葉片的表達(dá)量在幼苗期表達(dá)量低于花期表達(dá)量，PnAG1-2表現(xiàn)相反。在根部的表現(xiàn)為 PnAG1和PnAG3、PnAG1-1的表達(dá)量幼苗期高于花期，同時PnAG1-2的表現(xiàn)相反。干旱的程度大小也和表達(dá)上調(diào)程度密切相關(guān)，同時由于PnAG1和PnAG3在抗黃曲霉過程中出現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)情況，