銀杏葉提取物與轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)A20過(guò)表達(dá)在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、第一章:A20基因表達(dá)載體的構(gòu)建、質(zhì)粒的提取及體外鑒定
　　目的:1、構(gòu)建一種攜帶A20基因的表達(dá)載體。2、培養(yǎng)大腸桿菌，提取高濃度、高純度的質(zhì)粒DNA。3、質(zhì)粒DNA的體外鑒定。
　　方法:1、構(gòu)建成A20的基因表達(dá)載體pcDNA3.1-A20，并將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，用空質(zhì)粒載體pcDNA3.1作為對(duì)照，-20℃保存?zhèn)溆谩?、大腸桿菌采用固體LB培養(yǎng)基劃盤，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h，挑取單菌

2、落，接種于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速210r/min，培養(yǎng)12～16h，提取質(zhì)粒DNA，測(cè)定其濃度，并對(duì)其進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，以確定是目的基因。3、重組質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1、經(jīng)過(guò)酶切、提取、電泳鑒定后結(jié)果完全正確。2、體外轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，有綠色熒光表達(dá)的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)A20基因表達(dá)載體可有效轉(zhuǎn)染HK-

3、2細(xì)胞。
　　第二章:銀杏葉提取物與轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)A20過(guò)表達(dá)在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用
　　目的:1、建立一種穩(wěn)定、可靠的大鼠腎缺血再灌注損傷模型。2、觀察銀杏葉提取物及轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)A20過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用，為臨床防治腎IRI提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　方法:1、雄性SD大鼠，體重250～280g，用50mg/kg體重戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，打開(kāi)腹腔，分離左腎動(dòng)脈和靜脈，微型血管夾夾閉左腎動(dòng)靜脈

4、45min，夾閉期間行右腎切除術(shù)。45min后松開(kāi)血管夾，觀察大鼠左側(cè)腎臟血管再灌注情況并縫合腹部切口。制成大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2、技術(shù)熟練后，行大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型制作。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分四組:分別為生理鹽水組、A20組、銀杏葉組、A20+銀杏葉組，每組8只大鼠。術(shù)前48小時(shí)對(duì)生理鹽水組、A20組、A20+銀杏葉組，分別通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水、脂質(zhì)體pcDNA3.1-A20+生理鹽水250μl(15μl脂質(zhì)體加10μg構(gòu)建的

5、質(zhì)粒DNA混勻后加入生理鹽水至250μl)，銀杏葉組和A20+銀杏葉組于術(shù)前30min腹腔注射銀杏葉提取物50mg/kg。手術(shù)后24h收獲大鼠，分別由下腔靜脈采血5ml，取左側(cè)腎臟，腎臟組織分三部分，1/3置于10％中性福爾馬林緩沖液中固定，待作組織學(xué)檢查，另2/3組織分兩部分，速凍于液氮并轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱保存，行相關(guān)檢測(cè)。血清采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Scr、BUN，腎組織HE染色行病理學(xué)檢測(cè)，TUNEL法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡情況

6、，Westernblot法檢測(cè)A20蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)A20mRNA水平的表達(dá)，EMSA檢測(cè)NF-kB的活性。
　　結(jié)果:1、經(jīng)過(guò)練習(xí)，建立了比較穩(wěn)定的大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。手術(shù)成功率可達(dá)95％。2、A20組和A20+銀杏葉組血清Scr、BUN水平明顯低于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。A20+銀杏葉組與A20組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組腎小管都有不同程度的損傷，銀杏葉組、A20+銀杏葉組以腎小管上皮

7、細(xì)胞刷狀緣損傷為主，與生理鹽水組比較，腎組織病理?yè)p傷明顯減輕(P均＜0.05)。A20組與生理鹽水組比較，腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、壞死，蛋白管型等腎臟組織病理?yè)p傷減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;腎小管上皮細(xì)胞凋亡多見(jiàn)于遠(yuǎn)端小管，與生理鹽水組比較，各組凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);銀杏葉組和A20+銀杏葉組與A20組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少（P均＜0.05）;各組A20蛋白及mRNA水平表達(dá)

8、均有所升高，與生理鹽水組比較，A20組與A20+銀杏葉組升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）;各組NF-kB的活性均不同程度受抑制，與生理鹽水組比較，A20組與A20+銀杏葉組中，NF-kB活性受抑制更明顯。
　　結(jié)論:銀杏葉提取物與轉(zhuǎn)基因方法均能上調(diào)A20基因在體內(nèi)的表達(dá)，改善腎功能，減輕腎IRI的病理?yè)p害及腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到腎臟保護(hù)作用，且二者合用效果較為突出，其機(jī)制可能與A20抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，通過(guò)