乳腺癌中TRAF4通過上調(diào)β-catenin的表達活化和促進β-catenin核定位參與Wnt信號通路.pdf

1、前言：
　　TRAF4是TRAF家族的一個成員。TRAF4的功能并不像其他的TRAF家族成員，其功能仍然不清楚。β-catenin在乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生的過程中起到了重要的作用。β-catenin是Wnt信號傳導的關(guān)鍵因子。Razon LM和El-Diery WS，通過酵母雙雜交篩選，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TRAF4和β-catenin之間的相互作用，并且TRAF4似乎可以增強β-catenin的相關(guān)轉(zhuǎn)錄，以及保護β-catenin蛋白兔于被p

2、53基因的介導的降解途徑降解。這是一個有趣的發(fā)現(xiàn)，我們考慮TRAF4是否可以通過β-catenin影響Wnt信號通路。我們回顧文獻發(fā)現(xiàn)，TRAF4對Wnt信號通路的影響在非洲爪蟾胚胎組織是可以忽略的。但是，TRAF4是否與Wnt信號通路在腫瘤組織中有關(guān)系，例如乳腺癌組織，仍不清楚。此外，TRAF4最初被鑒定為在乳腺癌中擴增的基因，促進了細胞的遷移和乳腺癌轉(zhuǎn)移，這些功能很像β-catenin參與的功能。還有一個原因是，TRAF4可以調(diào)節(jié)N

3、F-κB活化，Wnt信號通路和NF-κB信號通路之間存在交叉調(diào)控。
　　出于這些原因，我們研究TRAF4與β-catenin在乳腺癌中的表達相關(guān)性和TRAF4對β-catenin的亞細胞分布和相應的調(diào)控機制的影響，并進一步確定在乳腺癌細胞中TRAF4和Wnt信號通路之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1、免疫組化
　　分析78例乳腺癌組織中TRAF4與β-catenin的表達相關(guān)性。
　　2、細胞培養(yǎng)
　　

4、正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MCF-7以及高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231。
　　3、免疫共沉淀
　　檢測TRAF4與β-catenin的結(jié)合狀況。
　　4、免疫熒光染色
　　檢測TRAF4與β-catenin的核漿定位及其共定位。
　　5、轉(zhuǎn)染
　　按照Attractene轉(zhuǎn)染試劑或HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染。
　　6、Western blo

5、t
　　應用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染TRAF4前后，β-catenin的變化:檢測干擾TRAF4前后β-catenin的變化和細胞核和細胞漿內(nèi)β-catenin的變化。
　　7、MTT
　　分析細胞的相對增殖能力。
　　8、統(tǒng)計分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)值以均值±標準差表示。P＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、TRAF4與β-cate

6、nin在乳腺癌中表達呈正相關(guān)
　　免疫組化分析結(jié)果顯示，TRAF4與β-catenin在乳腺癌組織中表達。TRAF4在乳腺組織中呈細胞核和細胞漿表達，β-catenin呈細胞膜，細胞漿和細胞核表達。在乳腺癌中TRAF4的表達與β-catenin表達呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　2、在乳腺癌中TRAF4與β-catenin相互作用
　　免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)，TRAF4與β-catenin在乳腺癌細胞中相結(jié)合。免疫熒光分析

7、說明TRAF4與β-catenin在乳腺癌細胞中存在共定位，并驗證了TRAF4和β-catenin乳腺癌細胞中的定位。
　　3、在乳腺癌中TRAF4促進β-catenin蛋白的表達和活化
　　在MDA-MB-231細胞中上調(diào)TRAF4后，β-catenin和活化β-catenin的表達量增加。在MCF-7細胞中，上調(diào)TRAF4后β-catenin蛋白總量不變，但是活化的β-catenin表達增加。
　　4、在乳腺癌中T

8、RAF4促進β-catenin蛋白的核定位
　　免疫熒光分析MDA-MB-231細胞中上調(diào)TRAF4和下調(diào)TRAF4后，β-catenin的細胞定位。結(jié)果表明TRAF4表達上調(diào)后，β-catenin細胞核定位增加。Western blot分別分析MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞的細胞漿和細胞核內(nèi)的β-catenin表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)TRAF4后細胞核內(nèi)β-catenin表達增加。
　　5、在乳腺癌細胞中TRAF4通

9、過調(diào)節(jié)β-catenin蛋白參與Wnt信號通路
　　CyclinD1和c-myc是Wnt信號通路的下游靶蛋白，TRAF4上調(diào)后cyclinD1和c-myc表達增加，TRAF4表達下調(diào)后cyclinD1和c-myc表達下調(diào)。在MDA-MB-231細胞中上調(diào)TRAF4后干擾掉β-catenin可以發(fā)現(xiàn)cyclinD1和c-myc的表達不增加，這說明TRAF4通過β-catenin調(diào)節(jié)cyclinD1和c-myc。
　　6、TRA

10、F4通過調(diào)節(jié)β-catenin蛋白的表達，促進細胞增殖
　　TRAF4可以促進MDA-MB-231細胞增殖，但是當上調(diào)TRAF4表達的同時下調(diào)β-catenin蛋白表達以后，TRAF4促進細胞增殖能力減弱。說明TRAF4通過β-catenin促進細胞的增殖。
　　7、在MCF-7細胞中，下調(diào)β-catenin蛋白不影響TRAF4表達
　　在MCF-7細胞中，下調(diào)β-catenin表達后，TRAF4表達量不變。說明β-c