TRAF4通過(guò)泛素化降解E2F1抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：
　　腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）是一組重要的銜接蛋白，主要存在于胞漿中。它們可與腫瘤因了壞死受體(TNFR)的胞漿部分及其他TRAF家族成員之間構(gòu)成二聚體或三聚體蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)NF-κ B，JNK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。TRAF家族成員之間具有相似的結(jié)構(gòu)特征，即其羧基端具有TRAF同源結(jié)構(gòu)域，氨基端含有環(huán)指/鋅指結(jié)構(gòu)域，環(huán)指結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)DNA-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，并

2、將信號(hào)向下游傳遞，近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)TRAFs的環(huán)指結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶的活性，可以促進(jìn)相關(guān)蛋白泛素化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　TRAF4是TRAF家族中特殊的一員，不與TNFR相結(jié)合，與其他TRAF家族成員之間也是微弱結(jié)合，在組織及細(xì)胞中TRAF4的定位和表達(dá)存在不同的觀點(diǎn)，不同研究證明其在細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中都有表達(dá)，但造成這種不同亞細(xì)胞定位的原因尚不明確。TRAF4在乳腺癌中存在過(guò)表達(dá)，我們實(shí)驗(yàn)組在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，

3、在乳腺癌細(xì)胞中TRAF4能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。它可以通過(guò)與PRMT5、p70s6k以及3-catenin的相互結(jié)合，激活NF-κB、mTOR和Wnt/β-catenin等信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，而對(duì)于凋亡機(jī)制的研究我們還了解甚少。
　　TRAF4與PRMT5能夠互相結(jié)合，并且我們認(rèn)為TRAF4能夠上調(diào)PRMT5的表達(dá)，調(diào)節(jié)其下游信號(hào)。文獻(xiàn)報(bào)道具有凋亡活性的轉(zhuǎn)錄因子E2F1是精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT5的底物，在體外和腫

4、瘤細(xì)胞中PRMT5都能甲基化E2F1，并通過(guò)負(fù)調(diào)控E2F1促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)TRAF4能夠上調(diào)PRMT5，下調(diào)E2F1及其促凋亡下游基因p73，TRAF4對(duì)凋亡活性的調(diào)節(jié)與E2F1的表達(dá)密切相關(guān)，但深入研究證實(shí)TRAF4對(duì)E2F1的調(diào)節(jié)作用并不依賴于PRMT5的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)TRAF4能夠與E2F1相互結(jié)合，并通過(guò)泛素化作用降解E2F1。
　　方法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　乳腺癌細(xì)胞MCF-

5、7應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含10％胎牛血清），在37℃，5％CO2的孵箱內(nèi)進(jìn)行孵育，每1-2天更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.25％胰酶消化進(jìn)行傳代、鋪板處理。
　　二、主要試劑
　　兔抗人E2F1抗體，購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，鼠抗人E2F1，TRAF4抗體，購(gòu)自美國(guó)BD公司。兔抗人TRAF4抗體，羊抗人p73抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa CruzeBiotechnology。兔抗人PRMT5抗體，購(gòu)自美國(guó)abcam

6、公司。鼠抗人HA標(biāo)簽抗體，購(gòu)自美國(guó)Cell Signalling Technology公司，鼠抗人GAPDH抗體，DAB酶底物顯色試劑盒和辣根酶標(biāo)記羊抗兔，羊抗鼠，兔抗羊第二抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫沉淀相關(guān)Protein A+G agarose，蛋白酶體抑制劑MG-132、Westernblot及IP細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。蛋白合成抑制劑(Cycloheximide)CHX，購(gòu)自意大利inalco spa公

7、司。DMEM高糖、L15培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。胰酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。
　　三、轉(zhuǎn)染
　　TRAF4野生型質(zhì)粒、HA-Ub質(zhì)粒來(lái)自Addgene(Cambridge，USA)，TRAF4-siRNA，E2F1-siRNA和PRMT5-siRNA由廣州銳博公司合成。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾分別根據(jù)Attractene轉(zhuǎn)染試劑和HiPerFect干擾試劑說(shuō)明書進(jìn)行。
　　四、細(xì)胞蛋白提取

8、　　PBS收取轉(zhuǎn)染或干擾48h的細(xì)胞，離心后((4℃，2000r,5min)，細(xì)胞沉淀內(nèi)加入細(xì)胞裂解液及相應(yīng)比例的蛋白酶抑制劑，冰上裂解30min，高速離心(4℃，12000r，20min)，吸取上清，即為總蛋白。
　　五、Western blot
　　應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)取蛋白濃度后，將等量蛋白通過(guò)8％的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5％脫脂牛奶在室溫條件下封閉2h，特異性一抗4℃孵育過(guò)

9、夜，第二天用HRP標(biāo)記的二抗室溫條件下孵育2h，隨后進(jìn)行發(fā)光（ECL法），并進(jìn)行條帶灰度值測(cè)定。
　　六、免疫共沉淀
　　取一定量含有總蛋白的細(xì)胞裂解液，加入1ug所需一抗和鼠/兔IgG4℃孵育過(guò)夜，第二天加入Protein A+G磁珠，4℃孵育4h，洗脫后收取免疫復(fù)合物進(jìn)行westernblot檢測(cè)。
　　七、免疫熒光
　　24孔板玻片上的細(xì)胞經(jīng)4％多聚甲醛固定20min，使用0.2％tritonⅩ-100對(duì)細(xì)

10、胞核進(jìn)行打孔15min，隨后用3％BSA封閉1h，加入特異性一抗，4℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)熒光二抗室溫孵育2h，并用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察TRAF4與E2F1的定位情況。
　　八、細(xì)胞凋亡
　　轉(zhuǎn)染或干擾48h后收集1×105個(gè)細(xì)胞，根據(jù)凱基細(xì)胞凋亡試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。
　　九、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

11、應(yīng)用t檢驗(yàn)和單因素方差進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。p＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、TRAF4能夠抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡
　　在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中雙向調(diào)控TRAF4，流式細(xì)胞分析顯示TRAF4能夠抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡。
　　二、TRAF4通過(guò)下調(diào)E2F1抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，但不依賴PRMT5
　　在MCF-7細(xì)胞中TRAF4能夠上調(diào)PRMT5，下調(diào)E2F1及其下游靶基因p73的表

12、達(dá)。而下調(diào)TRAF4表達(dá)的同時(shí)干擾了E2F1時(shí)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)E2F1明顯抑制了下調(diào)TRAF4后對(duì)p73及細(xì)胞凋亡率的上調(diào)作用。由此得出結(jié)論，TRAF4可以通過(guò)下調(diào)E2F1的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，p73在其中發(fā)揮重要作用。
　　然而，在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRAF4的同時(shí)干擾PRMT5后，E2F1的表達(dá)水平仍然呈現(xiàn)明顯減少的趨勢(shì)，提示我們TRAF4下調(diào)E2F1表達(dá)的作用并不依賴PRMT5。
　　三、TRAF4通過(guò)泛素化作用降解E

13、2F1
　　免疫熒光結(jié)果顯示在MCF-7細(xì)胞中TRAF4與E2F1存在相同的定位，并且免疫共沉淀結(jié)果顯示二者能夠互相結(jié)合。使用放線菌酮結(jié)果顯示TRAF4能夠衰減E2F1蛋白的半衰期。蛋白酶體相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示TRAF4能夠通過(guò)泛素化途徑降解E2F1。
　　結(jié)論：
　　在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中TRAF4與E2F1存在共定位，并二者能夠相互結(jié)合，TRAF4可以通過(guò)泛素化作用降解E2F1，并下調(diào)其表達(dá)水平，從而發(fā)揮其抑制凋亡的活性