TRIM59在乳腺癌中高表達并通過AKT信號通路促進腫瘤增殖和侵襲.pdf

1、1前言：
　　乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始一直呈上升的趨勢，乳腺癌已經(jīng)成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題[1-4]。乳腺并不是維持人體生命活動的重要器官，原位乳腺癌并不致命，但是由于乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性，細胞之間的連接松散，容易脫落。癌細胞一旦脫落，游離的癌細胞可以隨著血液和淋巴液播散全身，形成轉(zhuǎn)移，危機生命[5-9]。隨著生活水平的提高，人們對于自己的生活質(zhì)量的追求不斷提升

2、，對乳腺癌的治療不僅希望保證生命安全，也對自身的形象有更高的要求。因此尋找和鑒定乳腺癌的特異性分子標記物，對于早期診斷和治療乳腺癌至關(guān)重要。
　　TRIM(tripartite-motif protein)蛋白家族的名稱是由于其具有三個保守的結(jié)構(gòu)域而得來的[10，11]。TRIM蛋白家族由100多個成員組成，其中人類基因組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定出70個TRIM蛋白成員[10-12]。TRIM家族蛋白在生物體生長發(fā)育過程中有兩項最主要的生物

3、學(xué)功能:其一是通過干擾病毒的復(fù)制過程而發(fā)揮其抗病毒的功能[13-15];其二是發(fā)揮模式識別受體的功能，識別病毒的衣殼蛋白，調(diào)控生物體的天然免疫系統(tǒng)[16-19]。近年來多項研究表明TRIM蛋白家族成員參與調(diào)控細胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[20-25]。大量研究表明，TRIM家族蛋白與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TRIM24在肝癌[26]、乳腺癌[27]、前列腺癌[27]等腫瘤中的表達發(fā)生異常，即可發(fā)揮促癌基因的作

4、用，也可發(fā)揮抑癌基因的作用。TRIM28在直腸癌組織中過量表達，并且與患者的不良預(yù)后情況顯著相關(guān)，發(fā)揮重要的原癌基因功能。TRIM28在腸癌中過表達水平與低表達的p53顯著相關(guān)，且TRIM28高表達與患者總生存期和無進展生存期的縮短密切相關(guān)[28]。TRIM27在人宮頸癌細胞中過表達，使得腫瘤細胞對化療藥物順鉑產(chǎn)生抵抗性[29]。在卵巢癌患者組織中同樣檢測到了TRIM27的過表達現(xiàn)象，并且其過表達水平與化療耐藥性呈正相關(guān)[30]。最近有

5、研究發(fā)現(xiàn)TRIM59在多種腫瘤中表達升高，但其臨床意義和具體作用機制尚不明確。
　　本研究旨在探討TRIM59蛋白在乳腺癌組織中的表達情況及臨床意義。另外，我們還研究了TRIM59對乳腺癌細胞增殖、侵襲、細胞周期、凋亡等生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響及其分子機制。
　　2、材料與方法：
　　2.1、組織樣本
　　乳腺癌組織以及相應(yīng)癌旁正常組織取自于在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為乳腺癌并接受手術(shù)切除治療的患者。本研究經(jīng)過中

6、國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理學(xué)會的批準。
　　2.2、細胞培養(yǎng)
　　MCF-10A, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT474, BT594, T47D, MCF7, ZR-75-1以及SK-BR-3細胞系購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。培養(yǎng)細胞所用培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，其中包含10％胎牛血清，100 ug/ml的鏈霉素以及100U/ml青霉素。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。
　　

7、2.3、細胞轉(zhuǎn)染與干擾
　　轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒pCMV6-TRIM59以及空載質(zhì)粒購買于美國的Origene公司，轉(zhuǎn)染試劑Attractene transfection reagent購買于德國Qiagen公司。干擾所用SMARTpool siRNATRIM59以及陰性對照Non-targeting siRNA購買于美國Dharmacon公司。干擾試劑Dharmafectl reagent購買于美國Dharmacon公司。
　　2

8、.4、免疫組織化學(xué)
　　腫瘤組織首先經(jīng)過包埋，并制備4μm厚度的樣片。本實驗過程所用一抗為trim59，使用稀釋比例為1∶200。過氧化物酶反應(yīng)用DAB plus試劑盒，復(fù)染使用蘇木精染色液，封片前用濃度梯度酒精進行脫水。兩位病理專家對所有樣本進行隨機檢測，每個樣本隨機選取5個視野，每個視野在放大400倍條件下均可觀察到100個細胞。
　　2.5、 Western blot
　　本實驗所用抗體有TRIM59、cycli

9、n E/A/B、p-AKT、AKT、bcl-2、bcl-xl、 p53、 p21、p27(cell signaling technology)、GAPDH(Santa Cruz，USA)，辣根過氧化物酶耦合的二抗(Abcam，USA)。RIPA細胞裂解液中包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。蛋白定量使用BCA蛋白定量試劑盒。
　　2.6、 RNA提取以及RT-PCR
　　樣本總RNA的提取使用Trizol試劑。實時熒光定量PCR

10、實驗使用SYBR Greenmaster mix試劑盒。PCR實驗所用儀器為7500 Real-Time PCR System。內(nèi)參基因使用β-actin。目的基因的擴增倍數(shù)的測算方法依據(jù)2-△△Ct。本實驗重復(fù)3次。
　　2.7、細胞增殖實驗
　　MTT實驗:細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度約為每孔5×103個細胞，連續(xù)培養(yǎng)5天。每孔加入20μl5 mg/ml MTT溶液，并繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)基去除，每

11、孔加入150μl DMSO。用酶標儀進行檢測，檢測波長為490nm。集落形成實驗:細胞接種于直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿，接種密度約為1000個/皿。細胞連續(xù)培養(yǎng)2周，用PBS緩沖液漂洗細胞表面，并用吉薩姆染色液進行染色。在光學(xué)顯微鏡下進行觀察，超過50個細胞的集落即可進行計數(shù)。
　　2.8、細胞轉(zhuǎn)移和侵襲實驗
　　細胞侵襲實驗用24孔Transwell小室。將稀釋后的細胞懸液加入到transwell上室中，下室加入含15％胎

12、牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃條件下培養(yǎng)16小時。將未闖過基質(zhì)膠的細胞用棉簽輕輕擦去，將穿過基質(zhì)膠的細胞用4％多聚甲醛進行固定，用蘇木精進行染色。隨機選取5個視野并在顯微鏡下進行計數(shù)。
　　2.9、流式細胞術(shù)
　　收集經(jīng)過轉(zhuǎn)染及干擾的細胞，并用PBS緩沖液漂洗細胞。用250μl的緩沖液將細胞進行重懸，并用1％多聚甲醛進行固定。固定后加入5 mg/ml碘化丙啶或者5 mg/ml碘化丙啶及AnnexinⅤ/FITC。黑暗條件下

13、染色15分鐘后將細胞應(yīng)用于流式細胞儀，分別分析細胞的周期和凋亡水平。
　　2.10、統(tǒng)計分析
　　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所用軟件為SPSS16.0。分析trim59的表達模式與臨床病理因素之間的關(guān)系采用卡方檢驗法。其他處理組與對照組之間所得數(shù)據(jù)采用Student's t檢驗方法進行分析。P＜0.05表示兩組之間存在顯著差異。
　　3、結(jié)果：
　　3.1、 TRIM59在乳腺癌組織中表達升高
　　我們通過免疫組化的方法

14、檢測了95例乳腺癌組織和15例正常乳腺組織中TRIM59蛋白的表達情況。TRIM59主要在細胞漿和細胞膜上表達。參考文獻報道[31]，我們根據(jù)其染色強度和染色范圍，將染色分為4個等級。0分:0/0（強度/范圍）;1分:弱漿染色和/或≤25％漿染色;2分:中等強度漿染色和/或≤50％漿染色;3分:強漿染色和/或≥50％漿染色。其中0分和1分為低表達，2分和3分為高表達。95例乳腺癌組織中，TRIM59高表達比率為44.1％(42/95)。

15、在15例正常乳腺上皮中TRIM59表達為陰性或弱表達。以上結(jié)果說明，TRIM59在乳腺癌組織中高表達。
　　3.2、 TRIM59在乳腺癌中的臨床意義
　　TRIM59在乳腺癌組織中顯著上調(diào)與腫瘤較高的TNM分期(p=0.0056)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.0088)密切相關(guān)。但與患者的年齡(p=0.5226)，腫瘤的大小(p=0.6160)無顯著相關(guān)性。此外，TRIM59的高表達與乳腺癌患者雌激素受體缺失(p=0.0197)

16、和和孕激素受體缺失(p=0.0215)顯著相關(guān)。TRIM59在三陰性乳腺癌組織中的表達水平明顯高于非三陰性乳腺癌組織(p=0.0157)。采用Kaplan-Meier統(tǒng)計方法分析TRIM59表達水平與乳腺癌患者生存時間之間的關(guān)系。結(jié)果表明TRIM59表達量較高的患者生存時間低于TRIM59表達量較低的患者。
　　3.3、 TRIM59在乳腺癌細胞中的表達以及TRIM59轉(zhuǎn)染與干擾
　　通過Western blot檢測TRIM

17、59在正常乳腺上皮細胞(MCF-10A)和乳腺癌細胞系(MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT474, BT594, T47D, MCF-7, ZR-75-1,SK-BR-3)中的內(nèi)源表達水平。結(jié)果顯示，在正常乳腺上皮細胞MCF-10A中，TRIM59表達缺失。乳腺癌細胞系中，MDA-MB-453、BT474以及SK-BR-3細胞中TRIM59的表達水平較高，而BT594、MCF-7以及T47D細胞中TRIM59的表達水平

18、較低。分別選擇內(nèi)源表達量較低的MCF-7細胞和內(nèi)源表達量較高的SK-BR-3細胞進行TRIM59的轉(zhuǎn)染和干擾實驗，并通過western blot方法分析轉(zhuǎn)染以及干擾效率。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TRIM59后，MCF-7細胞中TRIM59的蛋白表達量顯著提高;而敲除TRIM59基因后，SK-BR-3細胞中TRIM59的蛋白表達量則明顯降低。
　　3.4、 TRIM59促進乳腺癌細胞增殖
　　將轉(zhuǎn)染以及干擾TRIM59的乳腺癌細胞分別應(yīng)用

19、于MTT實驗和集落形成實驗。MTT結(jié)果顯示: TRIM59過表達后，MCF-7細胞的增殖率提高;而敲除TRIM59后，SK-BR-3細胞的增殖率降低。集落形成實驗結(jié)果顯示，TRIM59過表達后，MCF-7細胞形成的集落數(shù)目增加（155±8.5 VS328±24）;而敲除TRIM59后，SK-BR-3細胞形成的集落數(shù)目減少（250±16.2 VS120±12.1）。
　　3.5、 TRIM59促進乳腺癌細胞的侵襲
　　我們將經(jīng)

20、過TRIM59轉(zhuǎn)染以及干擾的乳腺癌細胞系應(yīng)用于劃痕實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗以分析TRIM59對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力發(fā)揮的作用。劃痕實驗結(jié)果表明:MCF-7細胞中，TRIM59過表達使得乳腺癌細胞48小時的遷移距離較對照組明顯增加（62.6±3.1 VS93.6±4.2）;而在SK-BR-3細胞中，TRIM59表達缺失則導(dǎo)致乳腺癌細胞48小時的遷移距離較對照組減少（112.3±3.7 VS81±5.2）?；|(zhì)膠侵襲實驗表明TRIM59能夠

21、促進乳腺癌細胞侵襲。在MCF-7細胞中，TRIM59過表達使得乳腺癌細胞穿膜數(shù)目增加（41.6±V5.5S75.3±4.5）;而在SK-BR-3細胞中，TRIM59表達缺失則導(dǎo)致乳腺癌細胞穿膜數(shù)目減少（97.6±6.1 VS52.6±5.8）。
　　3.6、 TRIM59促進乳腺癌細胞進展
　　通過流式細胞術(shù)分析經(jīng)過TRIM59轉(zhuǎn)染以及siRNA TRIM59干擾該基因的乳腺癌細胞的周期變化。實驗結(jié)果顯示，TRIM59過表達

22、后，MCF-7細胞的S期所占比例升高（（S:22.6±1.2 VS31±1.1），G2期所占比例降低;（G2:39.2±0.9 VS30.6±1.4）。而在SK-BR-3細胞中，TRIM59表達缺失使得細胞S期所占比例降低(S:6.1±0.5 VS3.1±0.3)，G2期所占比例升高（G2:8.2±0.6 VS10.7±0.7）。
　　3.7、 TRIM59增強乳腺癌細胞的化療耐藥性
　　將經(jīng)過TRIM59轉(zhuǎn)染以及干擾的細胞

23、用順鉑進行干預(yù)，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，并通過流式細胞術(shù)分析細胞的凋亡水平變化。結(jié)果顯示:TRIM59過表達后，由順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡率較對照組明顯降低（21.2±1.3VS12.7±1.1）;而在SK-BR-3細胞中，TRIM59表達缺失后由順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡率較對照組明顯升高（10.8±0.9 VS17.6±1.3）。
　　3.8、 TRIM59調(diào)控乳腺癌細胞中周期和凋亡相關(guān)蛋白
　　通過western blot方法檢測分析

24、了細胞中與周期、凋亡相關(guān)指標的表達水平變化。結(jié)果顯示TRIM59過表達可上調(diào)乳腺癌細胞MCF-7中cyclinA，cyclinB，cyclinE，bcl-xl，bcl-2的表達水平，同時下調(diào)p21，p27的表達水平。而在敲除TRIM59基因后，SK-BR-3細胞中cyclinA，cyclinB，cyclinE，bcl-xl，bcl-2的表達量下調(diào)，同時p21，p27的表達量上調(diào)。
　　3.9、 TRIM59抑制caspase的剪切

25、和cytochrome c的釋放
　　通過western blot方法檢測細胞中與細胞程序性凋亡相關(guān)指標的表達水平變化。實驗結(jié)果表明，TRIM59過表達后，MCF-7細胞中cleaved-caspase3，cleaved-caspase9，cleaved-caspase PARP的表達量均顯著降低;而在SK-BR-3細胞中敲除TRIM59基因后，cleaved-caspase3，cleaved-caspase9，cleaved-c

26、aspase PARP的表達量顯著上調(diào)。此外，在TRIM59高表達的MCF-7細胞中還檢測到了cytochrome c的表達量較對照組下調(diào)，而在SK-BR-3細胞中，TRIM59表達缺失則導(dǎo)致cytochrome c表達量上調(diào)。
　　3.10、 TRIM59下調(diào)乳腺癌細胞中p53水平并上調(diào)p-AKT水平
　　檢測了細胞中多條信號通路的變化水平，發(fā)現(xiàn)TRIM59過表達可激活A(yù)KT信號通路，上調(diào)p-AKT的表達量;而使用siRN

27、A敲除TRIM59基因后，SK-BR-3細胞中p-AKT的表達量的表達量下調(diào)。此外，TRIM59過表達可下調(diào)MCF-7細胞中p53的表達量，而TRIM59表達缺失則上調(diào)細胞中p53的表達量。
　　3.11、 TRIM59促進乳腺癌細胞中p53的泛素化過程
　　免疫共沉淀實驗結(jié)果表明乳腺癌細胞中TRIM59過表達可促進p53的泛素化過程。
　　4、結(jié)論：
　　乳腺癌組織中TRIM59過表達并與腫瘤較高的TNM分期以

28、及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TRIM59的高表達與乳腺癌患者雌激素受體缺失(p=0.0197)和孕激素受體缺失(p=0.0215)顯著相關(guān)。TRIM59在三陰性乳腺癌組織中的表達水平明顯高于非三陰性乳腺癌組織(p=0.0157)。TRIM59表達量較高的患者生存時間低于TRIM59表達量較低的患者。
　　TRIM59過表達可促進乳腺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及周期進展，并增強細胞對順鉑的化療抵抗性。TRIM59過表達激活乳腺癌細胞中的AKT