DKK1通過β-catenin-MMP7信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景:
　　肝細(xì)胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，其致死率在腫瘤相關(guān)疾病中排名第三位。近年來雖然早期診斷，以及放療、化療和手術(shù)治療的聯(lián)合使用使肝癌的治療有了一定的提高，然而，到目前為止，肝癌患者的預(yù)后仍然不容樂觀。最近有幾篇報(bào)道表明DKK1的高表達(dá)和肝癌的發(fā)展密切相關(guān)。然而，DKK1在肝癌中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制仍不清楚。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本文以肝癌細(xì)胞和肝癌組織為研究對(duì)象，以期探討DKK1在肝癌中的

2、生物學(xué)功能及其潛在的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　采用RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常肝細(xì)胞(QSG-7701)和四種肝癌細(xì)胞(Hep G2，SMMC-7721，HuH-7和BEL-7402)中DKK1 mRNA和蛋白的表達(dá)。采用免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中DKK1和β-catenin的表達(dá)。采用MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DKK1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。采用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移

3、能力。使用GSK3β抑制劑LiCl和β-catenin抑制劑IWP-2來進(jìn)一步確認(rèn)β-catenin在DKK1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞中β-catenin，MMP7，以及LRP6 mRNA的表達(dá)，采用Western blotting檢測(cè)β-catenin，MMP7，LRP6，GSK3β和c-Myc等蛋白的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、與正常的肝細(xì)胞QSG-7701相比，DKK1的mRN

4、A和蛋白水平在肝癌細(xì)胞系HuH-7，SMMC-7721和BEL-7402中明顯高表達(dá)。值得注意的是:DKK1的mRNA和蛋白水平在BEL-7402細(xì)胞中表達(dá)最高，在Hep G2細(xì)胞中表達(dá)最低。
　　2、當(dāng)DKK1表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)，肝癌細(xì)胞的增殖率并不改變?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:DKK1表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)時(shí)只能微弱的增加或減少克隆數(shù)目，但與對(duì)照組相比并沒有顯著性差異。
　　3、DKK1高表達(dá)能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的傷口愈合率，反之，

5、當(dāng)DKK1低表達(dá)時(shí)能顯著降低肝癌細(xì)胞的傷口愈合率。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，DKK1穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的侵襲和遷移率;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DKK1 shRNA的肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出更低的侵襲和遷移能力。與這些結(jié)果相一致的是，與健側(cè)正常的肝組織相比，DKK1在肝癌組織中明顯高表達(dá);而且，與非轉(zhuǎn)移性的肝癌組織相比較，DKK1在轉(zhuǎn)移性的肝癌組織中表達(dá)更高。
　　4、免疫組化結(jié)果表明:在肝癌組織中，DKK1的表達(dá)和β-caten

6、in表達(dá)成正相關(guān)。而且，DKK1表達(dá)上調(diào)不僅能明顯促進(jìn)Hep G2細(xì)胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平，而且能明顯增加Hep G2細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞漿/細(xì)胞核的累積，以及增強(qiáng)具有野生型TCF結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶活性。反之，DKK1表達(dá)下調(diào)能明顯減少BEL-7402細(xì)胞中β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)，以及降低具有野生型TCF結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶活性。
　　5、使用β-catenin抑制劑IWP-2處理后，D

7、KK1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移被明顯降低。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DKK1 shRNA的肝癌細(xì)胞中，上調(diào)β-catenin的表達(dá)能部分恢復(fù)DKK1 shRNA對(duì)β-catenin的轉(zhuǎn)錄和肝癌細(xì)胞的侵襲的抑制作用。同樣，當(dāng)使用GSK3β抑制劑LiCl處理后，DKK1 shRNA對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力的抑制作用也被顯著地解除。
　　6、RT-PCR結(jié)果表明:盡管DKK1表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)能顯著改變?chǔ)?catenin的mRNA水平，但并不影響LR

8、P6細(xì)胞內(nèi)域和細(xì)胞外域的轉(zhuǎn)錄。Western blotting結(jié)果同樣表明:DKK1表達(dá)上調(diào)或下調(diào)不會(huì)影響LRP6細(xì)胞內(nèi)域和GSK3β的蛋白表達(dá)。然而，DKK1表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)能明顯增加或者減少β-catenin和其下游靶點(diǎn)c-Myc的蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):β-catenin抑制劑IWP-2能明顯抑制β-catenin的蛋白表達(dá)，而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DKK1 shRNA的肝癌BEL-7402細(xì)胞中，GSK3β抑制劑LiCl能部分恢復(fù)DK

9、K1 shRNA對(duì)β-catenin的蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　7、DKK1表達(dá)上調(diào)能顯著增加Hep G2細(xì)胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平，反之，當(dāng)用shRNA沉默DKK1后，肝癌細(xì)胞BEL-7402中β-catenin的mRNA和蛋白水平顯著地降低。而且，β-catenin抑制劑IWP-2能夠劑量依賴性的降低肝癌細(xì)胞中MMP7蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染MMP7質(zhì)粒的Hep G2細(xì)胞表現(xiàn)出更高的侵襲力。
　　

10、實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1、DKK1在肝癌細(xì)胞中是高表達(dá)的。
　　2、DKK1對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖沒有影響。
　　3、DKK1顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而且，DKK1在肝癌組織中明顯高表達(dá);此外，與非轉(zhuǎn)移性的肝癌組織相比較，DKK1在轉(zhuǎn)移性的腫瘤組織中表達(dá)更高。
　　4、利用功能獲得和功能喪失實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)DKK1是通過一種非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)肝癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。