含小鼠FcγRⅡb基因慢病毒載體對(duì)MRL-lpr SLE小鼠的作用研究.pdf

1、目的：包裝含小鼠FcγRⅡB慢病毒表達(dá)載體，觀察其在小鼠B細(xì)胞表面的表達(dá)并研究其抑制性受體對(duì)MRL/lpr SLE小鼠的作用研究。
　　方法：將慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒調(diào)節(jié)質(zhì)粒Tet分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞，分別包裝表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒，分別測(cè)定表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒感染滴度。將MRL/lpr SLE小鼠預(yù)防動(dòng)物（周齡8周左右）40只隨機(jī)分成病毒液100ul組、病毒液200ul組、預(yù)防空病毒組

2、（不含F(xiàn)cγRIIb基因）、預(yù)防對(duì)照組（生理鹽水組）四組，每組10只，再將模型動(dòng)物（周齡16周左右）組40只隨機(jī)分成病毒100ul組、200ul組、治療空病毒組（不含 FcγRIIb基因）和治療對(duì)照組（生理鹽水組），每組10只。通過(guò)尾靜脈注射將病毒液轉(zhuǎn)導(dǎo)到MRL/lpr SLE小鼠體內(nèi)，連續(xù)注射四周，每周一次。注射完成后，觀察二周后提尾反射法收集小鼠尿液檢測(cè)小鼠尿蛋白，眼眶內(nèi)眥靜脈取血約500μL后檢測(cè)小鼠抗核抗體和抗雙鏈DNA含量，取

3、血完成后處死小鼠，取各組小鼠新鮮脾臟組織進(jìn)行研磨、淋巴細(xì)胞分離后再磁珠分選檢測(cè)B細(xì)胞上FcγRIIb基因的mRNA和蛋白的表達(dá)并做腎臟、淋巴結(jié)、肝臟的病理切片。同時(shí)各組的蛋白采用Western blot法和磷酸化Western blot，觀察B細(xì)胞通路上的Btk、Ship1、Pyn總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)來(lái)研究其可能的機(jī)制。數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表利用Gra

4、phPad Prism5.0軟件繪制。
　　結(jié)果：
　　1．表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒滴度均達(dá)106TU/mL。
　　2．MRL/lpr SLEFcγRⅡB mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果：預(yù)防和治療空病毒組與對(duì)照組相比無(wú)意義，病毒組（含100μL和200μL組）與空病毒組相比FcγRⅡB mRNA和蛋白增加。
　　3.MRL/lpr SLE小鼠尿蛋白、抗雙鏈DNA抗體含量檢測(cè)結(jié)果：預(yù)防和治療空病毒組與對(duì)照組相比無(wú)意義，

5、病毒組（含100μL和200μL組）與空病毒組相比尿蛋白、抗雙鏈DNA含量減少。
　　4.1、對(duì)照組B細(xì)胞上的Btk、Lyn與空病毒組相比無(wú)意義，預(yù)防病毒組中的Btk（含100μL和200μL組）與空病毒組相比蛋白含量明顯減少，p<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)防200μL組Btk總蛋白與100μL組相比明顯下降；治療組B細(xì)胞上的Btk各組蛋白無(wú)變化。預(yù)防病毒組中的 Lyn100μL與空病毒組相比蛋白含量明顯增加，p<0.01，有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義；200μL組與100μL組相比明顯下降；治療病毒組中的Lyn100μL組與200μL組相比明顯下降。Ship1總蛋白預(yù)防和治療各組無(wú)變化。
　　4.2、預(yù)防空病毒組Btk磷酸化、Lyn磷酸化和Ship1磷酸化水平與對(duì)照組比較沒(méi)有變化。預(yù)防病毒200μL組磷酸化Btk、磷酸化Lyn和磷酸化Ship1與空病毒組相比表達(dá)水平明顯減少，p<0.01，預(yù)防病毒100μL組與空病毒組相比無(wú)意義。預(yù)防病毒200μL組與100μL組相比明

7、顯下降。治療空病毒組Btk磷酸化、Lyn磷酸化和Ship1磷酸化水平與對(duì)照組比較沒(méi)有變化。治療病毒200μL組磷酸化Btk和磷酸化Ship1與空病毒組相比明顯增加，p<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療病毒100μL組磷酸化Lyn與空病毒組相比蛋白含量明顯增加，p<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療病毒200μL組與100μL組相比明顯升高。
　　5．病理結(jié)果：
　　A：腎臟：HE染色顯示，預(yù)防組小鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)內(nèi)廣泛性血管充血擴(kuò)張，

8、周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；病變腎小球內(nèi)可見細(xì)胞數(shù)量增多，體積輕微增大或正常，部分腎小球周圍有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　治療組腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)內(nèi)廣泛性血管充血擴(kuò)張，尤其髓質(zhì)區(qū)和腎小球毛細(xì)血管較明顯，葉間動(dòng)脈以及弓形動(dòng)脈擴(kuò)張，官腔不整，周圍大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；髓質(zhì)區(qū)彌漫性腎小球輕度增生性改變，病變腎小球內(nèi)可見細(xì)胞數(shù)量增多，體積輕微；小球周圍多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球毛細(xì)血管團(tuán)萎縮，硬化。病毒預(yù)防組和治療組（100μL和200μL）較各自對(duì)照組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

9、、彌漫性腎小球增生性改變較輕。
　　B：肝臟：預(yù)防組小鼠肝細(xì)胞廣泛性胞漿疏松化，中央靜脈周圍多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域中央靜脈和肝血竇擴(kuò)張；部分區(qū)域匯管區(qū)纖維組織增生，小血管擴(kuò)張并大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　治療組小鼠肝細(xì)胞廣泛性胞漿疏松化，中央靜脈周圍大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并分割肝小葉，部分區(qū)域中央靜脈和肝血竇擴(kuò)張，小血管擴(kuò)張并大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域病變嚴(yán)重，肝小葉內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并分割肝小葉，可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，肝小葉幾乎被

10、淋巴細(xì)胞取代，小葉結(jié)構(gòu)破壞。病毒預(yù)防組和治療組（100μL和200μL）較各自對(duì)照組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。
　　C：淋巴結(jié)：預(yù)防組小鼠淋巴結(jié)輕度增殖性改變，淋巴結(jié)固有結(jié)構(gòu)清晰，淋巴濾泡內(nèi)多量淋巴細(xì)胞，偶見生發(fā)中心；模型小鼠淋巴結(jié)以增殖性改變?yōu)橹鳎饕憩F(xiàn)為淋巴小結(jié)體積增大，淋巴濾泡增生，大量淋巴細(xì)胞增生，部分區(qū)域可見多量組織細(xì)胞增生，幾乎未見生發(fā)中心，以至于皮質(zhì)髓質(zhì)分界不清，嚴(yán)重病變可見淋巴結(jié)固有結(jié)構(gòu)消失。病毒預(yù)防組（100μL和20