利用慢病毒載體制備轉基因小鼠和生胚胎的研究.pdf

1、慢病毒載體源于HIV-1前病毒(HIV-1 provirus)基因組。其宿主范圍廣,可以感染分裂和非分裂細胞；整合效率高,并可以使外源基因穩(wěn)定長期地表達。慢病毒載體已經(jīng)成功地應用于多種轉基因動物的生產(chǎn)。本試驗使用三質粒系統(tǒng)的慢病毒載體,它屬于自我失活性載體,并含有WPRE等調(diào)控元件。
　　 Fat-1基因來源于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans),其表達產(chǎn)物為一種ω-3不飽和脂肪酸脫氫酶?？梢詫ⅵ?6多不

2、飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)轉化成ω-3PUFAs,提高了動物體內(nèi)ω-3 PUFAs的含量。ω-3 PUFAs對人類的健康有重要作用,可以提高機體免疫力,預防多種心血管疾病等。本試驗構建了由IRES介導的可同時表達Fat—1基因和標記基因EGFP的慢病毒載體。為后續(xù)轉基因動物的生產(chǎn)奠定了基礎。
　　 以往的慢病毒包裝方法效率較低,且結果不穩(wěn)定。為提高慢病毒包裝效率,本試驗研究比

3、較了貼壁和懸浮293T細胞的磷酸鈣法慢病毒包裝效果。結果表明,利用懸浮細胞獲得的病毒滴度較貼壁細胞高近3.5倍,同時,轉染懸浮細胞的進行慢病毒包裝具有很好的重復性,且懸浮細胞直接用于病毒包裝,節(jié)省了至少24小時細胞培養(yǎng)時間。因此,本試驗建立了懸浮細胞慢病毒高效包裝技術。
　　 本試驗研究了慢病毒與精子共孵育后體外受精制備轉基因動物的方法。在小鼠和牛上重復多次均沒有得到陽性胚胎。為了研究受精過程對慢病毒感染胚胎的影響,本試驗采用卵

4、周隙顯微注射的方法,用低滴度的病毒(106 TU/ml)分別感染小鼠受精卵和卵母細胞。受精卵組的陽性率為8.3％,卵母細胞組沒有得到陽性胚胎。此結果表明受精過程并沒有明顯提高慢病毒感染小鼠胚胎的效率。
　　 為了研究慢病毒載體在制備轉基因牛上的應用,本試驗分別取卵母細胞、受精卵、2～4細胞胚胎、8～16細胞胚胎、16細胞以上的桑葚胚,采用滴度為108 TU/ml的慢病毒進行透明帶下顯微注射。結果:受精卵組和2～4細胞胚胎組都沒有