慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的初步研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用于研究基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因治療、器官移植、建立疾病的動(dòng)物模型和畜牧業(yè)中用于改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能等方面最理想的試驗(yàn)材料,它是聯(lián)系分子、細(xì)胞水平和活體動(dòng)物水平研究的橋梁。用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的方法有很多種,如:DNA原核顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞法、體細(xì)胞核移植法和精子載體法等,慢病毒感染轉(zhuǎn)法是目前最為普遍的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的方法之一。到目前為止,慢病毒感染法已成功制備出了轉(zhuǎn)基因大小鼠,大

2、型哺乳動(dòng)物如牛、羊和豬以及家禽等,且獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率較傳統(tǒng)方法高出許多。小鼠因其獨(dú)特的生理和遺傳特性,已成為生命科學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)行基因功能研究、發(fā)育生物學(xué)研究、疾病動(dòng)物模型等最理想的模式動(dòng)物。本研究在構(gòu)建PBD2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的過程中,初步探索了昆明小鼠的超數(shù)排卵條件、小鼠胚胎的拾取方法、胚胎體外培養(yǎng)條件和慢病毒與胚胎共培養(yǎng)的存活率分析等方面；通過對(duì)這些條件的摸索,然后建立慢病毒感染法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的平臺(tái),為今后建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型,進(jìn)而

3、研究基因功能和研究動(dòng)物疾病發(fā)病機(jī)制等方面奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將主要研究的結(jié)果報(bào)告如下:
　　 1.復(fù)制缺陷型慢病毒的包裝
　　 本研究所用的是第四代慢病毒載體系統(tǒng),一個(gè)骨架質(zhì)粒和三個(gè)包裝質(zhì)粒構(gòu)成。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的pCA-PBD2載體,我們將PBD2序列和pCA載體上的chickenβ-actin promoter(CBAP)真核表達(dá)強(qiáng)啟動(dòng)子序列、chickenβ—actin intron(CBAI)和rabbitβ-gl

4、obin intron(RBAI)內(nèi)含子序列一起連入慢病毒骨架載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒。然后共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞,包裝高滴度的復(fù)制缺陷性的重組慢病毒。本研究包裝濃縮慢病毒滴度達(dá)7.2×106TU/ml,體外感染無透明帶胚胎實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,病毒滴度達(dá)到在104 TU/ml時(shí),感染率100％。在慢病毒滴度為104 TU/ml時(shí),本研究比較分析了慢病毒與各個(gè)階段胚胎共培養(yǎng)后的感染存活率,1-細(xì)胞、2-細(xì)胞和4-細(xì)胞階段的胚胎可以在與慢病毒共培養(yǎng)8h以

5、內(nèi),進(jìn)行輸卵管移植,8-細(xì)胞階段的胚胎在感染后8-12h內(nèi)立即進(jìn)行子宮移植,這些條件為慢病毒感染法制備轉(zhuǎn)基因小鼠提供了新的思路。
　　 2.小鼠超排和胚胎的體外培養(yǎng)
　　 動(dòng)物早期胚胎的體外培養(yǎng)是慢病毒與胚胎共感染法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。超數(shù)排卵對(duì)小鼠胚胎的獲取起著決定性的作用,本研究通過對(duì)注射激素的不同劑量和兩種激素注射的不同時(shí)間間隔進(jìn)行比較,結(jié)果顯示10IU/只是本研究所用實(shí)驗(yàn)小鼠的最佳劑量,注射激素的時(shí)間間隔為

6、48h；通過對(duì)取胚方法的比較發(fā)現(xiàn),用子宮沖胚與體外培養(yǎng)相結(jié)合的方法,所獲得8-細(xì)胞及桑葚胚胚胎要優(yōu)于子宮沖胚和體外培養(yǎng)。現(xiàn)階段,常用的胚胎培養(yǎng)液種類很多,本研究選擇了M16和KSOM培養(yǎng)液進(jìn)行胚胎的體外培養(yǎng)比較,結(jié)果表明,兩種培養(yǎng)液進(jìn)行胚胎的體外短期培養(yǎng)效果不明顯。在培養(yǎng)方法方面,本研究比較了微滴培養(yǎng)法和開放式培養(yǎng)兩種方法對(duì)8-細(xì)胞和桑葚胚胚胎發(fā)生率以及體外培養(yǎng)48h的胚胎死亡率,結(jié)果顯示,微滴培養(yǎng)法在胚胎體外短期培養(yǎng)要優(yōu)于開放式培養(yǎng)。