慢病毒介導轉基因小鼠胚胎的初步研究.pdf

1、轉基因動物模型已成為生命科學和醫(yī)學領域中用于研究基因的結構與功能、基因治療、器官移植、建立疾病的動物模型和畜牧業(yè)中用于改善動物的生產性能等方面最理想的試驗材料,它是聯(lián)系分子、細胞水平和活體動物水平研究的橋梁。用于轉基因動物制備的方法有很多種,如:DNA原核顯微注射法、逆轉錄病毒介導法、胚胎干細胞法、體細胞核移植法和精子載體法等,慢病毒感染轉法是目前最為普遍的轉基因動物制備的方法之一。到目前為止,慢病毒感染法已成功制備出了轉基因大小鼠,大

2、型哺乳動物如牛、羊和豬以及家禽等,且獲得轉基因動物的效率較傳統(tǒng)方法高出許多。小鼠因其獨特的生理和遺傳特性,已成為生命科學領域中進行基因功能研究、發(fā)育生物學研究、疾病動物模型等最理想的模式動物。本研究在構建PBD2轉基因小鼠模型的過程中,初步探索了昆明小鼠的超數(shù)排卵條件、小鼠胚胎的拾取方法、胚胎體外培養(yǎng)條件和慢病毒與胚胎共培養(yǎng)的存活率分析等方面；通過對這些條件的摸索,然后建立慢病毒感染法制備轉基因小鼠的平臺,為今后建立轉基因小鼠模型,進而

3、研究基因功能和研究動物疾病發(fā)病機制等方面奠定基礎?，F(xiàn)將主要研究的結果報告如下:
　　 1.復制缺陷型慢病毒的包裝
　　 本研究所用的是第四代慢病毒載體系統(tǒng),一個骨架質粒和三個包裝質粒構成。根據(jù)本實驗室已經構建好的pCA-PBD2載體,我們將PBD2序列和pCA載體上的chickenβ-actin promoter(CBAP)真核表達強啟動子序列、chickenβ—actin intron(CBAI)和rabbitβ-gl

4、obin intron(RBAI)內含子序列一起連入慢病毒骨架載體,構建重組質粒。然后共轉染293ft細胞,包裝高滴度的復制缺陷性的重組慢病毒。本研究包裝濃縮慢病毒滴度達7.2×106TU/ml,體外感染無透明帶胚胎實驗結果顯示,病毒滴度達到在104 TU/ml時,感染率100％。在慢病毒滴度為104 TU/ml時,本研究比較分析了慢病毒與各個階段胚胎共培養(yǎng)后的感染存活率,1-細胞、2-細胞和4-細胞階段的胚胎可以在與慢病毒共培養(yǎng)8h以

5、內,進行輸卵管移植,8-細胞階段的胚胎在感染后8-12h內立即進行子宮移植,這些條件為慢病毒感染法制備轉基因小鼠提供了新的思路。
　　 2.小鼠超排和胚胎的體外培養(yǎng)
　　 動物早期胚胎的體外培養(yǎng)是慢病毒與胚胎共感染法制備轉基因動物的關鍵環(huán)節(jié)。超數(shù)排卵對小鼠胚胎的獲取起著決定性的作用,本研究通過對注射激素的不同劑量和兩種激素注射的不同時間間隔進行比較,結果顯示10IU/只是本研究所用實驗小鼠的最佳劑量,注射激素的時間間隔為

6、48h；通過對取胚方法的比較發(fā)現(xiàn),用子宮沖胚與體外培養(yǎng)相結合的方法,所獲得8-細胞及桑葚胚胚胎要優(yōu)于子宮沖胚和體外培養(yǎng)?，F(xiàn)階段,常用的胚胎培養(yǎng)液種類很多,本研究選擇了M16和KSOM培養(yǎng)液進行胚胎的體外培養(yǎng)比較,結果表明,兩種培養(yǎng)液進行胚胎的體外短期培養(yǎng)效果不明顯。在培養(yǎng)方法方面,本研究比較了微滴培養(yǎng)法和開放式培養(yǎng)兩種方法對8-細胞和桑葚胚胚胎發(fā)生率以及體外培養(yǎng)48h的胚胎死亡率,結果顯示,微滴培養(yǎng)法在胚胎體外短期培養(yǎng)要優(yōu)于開放式培養(yǎng)。