PLGA雙層支架負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損.pdf

1、第一部分PLGA雙層多孔支架的設(shè)計(jì)、制備及其生物相容性
　　目的:制備不同孔徑孔隙率PLGA雙層支架及其生物相容性研究。
　　方法:采用室溫模壓/粒子浸出法制備上下層不同孔徑孔隙率雙層支架。將聚乙交酯-丙交酯(PLGA)溶于二氯甲烷后與不同粒子大小的氯化鈉晶體致孔劑（氯化鈉粒子大小范圍有50-450μm）或不同質(zhì)量比的氯化鈉致孔劑混合，然后填入預(yù)制的模具中模壓成型24h，脫模以后，得到柱狀的混合物。不同粒子大小致孔劑或不同含

2、量致孔劑的柱狀混合物通過(guò)二氯甲烷粘合起來(lái)，然后裁剪成特定的尺寸。將致孔劑用去離子水浸出以后，即得到所需的雙層支架。同時(shí)將分離培養(yǎng)獲得的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)接種于PLGA雙層支架，體外培養(yǎng)1周后掃描電子顯微鏡觀察。
　　結(jié)果:成功獲得直徑4 mm、高度5 mm的PLGA雙層多孔支架，其中不同孔徑的5種，不同孔隙率的3種。所有支架上層高度1mm、下層高度4mm。電鏡觀察示支架孔的形態(tài)良好，孔與孔之間相通，上下層整合一體且相

3、互連通。BMSCs接種于支架體外培養(yǎng)后，細(xì)胞在所有支架的孔壁上黏附良好，可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。
　　結(jié)論:室溫模壓/粒子浸出法可制備不同孔徑孔隙率的PLGA雙層支架，且PLGA雙層支架生物相容性良好。
　　第二部分PLGA雙層支架不同孔徑對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損修復(fù)效果的影響
　　目的:探討一體化PLGA雙層支架負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的可行性，了解不同孔徑雙層支架對(duì)骨軟骨缺損修復(fù)效果的影響。
　　方

4、法:采用室溫模壓/粒子浸出法以PLGA為原料制備5組不同孔徑的一體化雙層多孔支架，致孔劑粒子大小范圍為50-450μm。來(lái)自新西蘭大白兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)用熒光染料DiI標(biāo)記后，以1×106/20μl接種于雙層PLGA支架的軟骨層，體外共培養(yǎng)1周，制成雙層PLGA支架-細(xì)胞復(fù)合物，并在電鏡下觀察。接種細(xì)胞或相應(yīng)未接種細(xì)胞的雙層支架植入兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型（直徑4 mm，深度5 mm）。于術(shù)后6周和12周取材行大體觀察、組

5、織學(xué)評(píng)分及免疫組織化學(xué)染色觀察。術(shù)后6周標(biāo)本一分為二切開(kāi)，部分標(biāo)本做冰凍切片，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下示蹤BMSCs。另外，12周標(biāo)本一分為二切開(kāi)，取一半行real time-PCR檢測(cè)基Ⅱ膠原(Collagen typeⅡ，ColⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan，AGC)及Ⅰ型膠原(Collagen typeⅠ，ColⅠ)三種基因相對(duì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:成功獲得5種不同孔徑PLGA雙層支架（孔徑大小范圍為50-450μm）。

6、電鏡觀察示BMSCs在支架內(nèi)生長(zhǎng)良好。術(shù)后6周，熒光顯微鏡下觀察見(jiàn)DiI標(biāo)記的細(xì)胞存活于缺損區(qū)。12周大體觀察顯示支架B（軟骨層孔徑100-200μm、骨層孔徑300-450μm）負(fù)載細(xì)胞修復(fù)的組織表面光整，新生組織和周邊界限不清，質(zhì)地接近正常組織;其他支架植入物都有不同程度的修復(fù)，但差于接種細(xì)胞的支架B。組織學(xué)評(píng)分顯示負(fù)載細(xì)胞的支架B組評(píng)分最低，和其他支架組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后12周免疫組織化學(xué)染色示負(fù)載細(xì)胞的

7、支架B標(biāo)本軟骨區(qū)ColⅡ及軟骨下骨區(qū)ColⅠ表達(dá)均強(qiáng)陽(yáng)性。另外，12周后負(fù)載細(xì)胞的支架B組ColⅡ基因表達(dá)水平最高，和其他植入物比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。盡管負(fù)載細(xì)胞的支架B組AGC的表達(dá)水平最高，但各組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。ColⅠ表達(dá)水平支架B和支架D（軟骨層孔徑300-450μm、骨層孔徑100-200μm）間有明顯差異(P＜0.05)，其他組之間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:

8、一體化PLGA雙層支架負(fù)載BMSCs支持軟骨及軟骨下骨的同時(shí)再生，其中軟骨層孔徑100-200μm、骨層孔徑300-450μm的PLGA雙層支架修復(fù)效果最好。雙層多孔支架的不同孔徑對(duì)骨軟骨缺損修復(fù)效果有影響。
　　第三部分PLGA雙層支架不同孔隙率對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損修復(fù)效果的影響
　　目的:探討不同孔隙率PLGA雙層支架負(fù)載BMSCs修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的可行性，分析不同孔隙率雙層支架對(duì)骨軟骨缺損修復(fù)的影響。
　　

9、方法:篩選粒子大小為200-300μm的氯化鈉晶體致孔劑，和PLGA按不同質(zhì)量比混合，采用室溫模壓/粒子浸出法制備3組不同孔隙率的一體化雙層多孔PLGA支架。然后對(duì)不同孔隙率3種支架行機(jī)械力學(xué)性能檢測(cè)。用DiI標(biāo)記BMSCs，以1×106/20μl接種于雙層PLGA支架的軟骨層，體外共培養(yǎng)1周，制成雙層PLGA支架-細(xì)胞復(fù)合物，并在電鏡下觀察。將接種細(xì)胞或相應(yīng)未接種細(xì)胞的雙層支架植入兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型（直徑4 mm，深度5 mm）。

10、于術(shù)后6周和12周取材行大體觀察、組織學(xué)評(píng)分及免疫組織化學(xué)染色觀察。術(shù)后6周標(biāo)本一分為二切開(kāi)，部分標(biāo)本做冰凍切片，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下示蹤BMSCs。另外，12周標(biāo)本同樣一分為二切開(kāi)，取一半行real time-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:成功獲得3種不同孔隙率PLGA雙層支架，孔隙率范圍為77％-92％，孔徑大小范圍均為200-300μm。力學(xué)性能結(jié)果顯示支架A（軟骨層孔隙率92％、骨層孔隙率77％）應(yīng)力應(yīng)變曲

11、線有兩個(gè)斜率，而支架B（軟骨層、骨層孔隙率均為85％）和C（軟骨層孔隙率77％、骨層孔隙率92％）只有一個(gè)斜率。支架A軟骨層的壓縮模量E1:3.8±1.1 MPa，骨層壓縮模量E2:29.1±5.0 MPa。支架B壓縮模量為16.1±3.2 MPa，支架C骨層壓縮模量為0.7±0.2 MPa，軟骨層未檢測(cè)出。電鏡檢測(cè)顯示BMSCs在支架內(nèi)生長(zhǎng)良好。術(shù)后6周，熒光顯微鏡下觀察見(jiàn)DiI標(biāo)記的細(xì)胞存活于缺損區(qū)。12周大體觀察顯示支架A負(fù)載細(xì)胞

12、修復(fù)的組織表面光整，新生組織和周邊界限模糊，質(zhì)地接近正常組織;其他支架植入物都有不同程度的修復(fù)，但差于接種絀胞的支架A。組織學(xué)評(píng)分（最高總分值減去所評(píng)分值）顯示接種細(xì)胞的支架A組評(píng)分最高，和支架C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。術(shù)后12周免疫組織化學(xué)染色示接種細(xì)胞的支架A組軟骨區(qū)ColⅡ及軟骨下骨區(qū)ColⅠ表達(dá)均強(qiáng)陽(yáng)性。另外，12周后新生組織基因表達(dá)水平顯示接種細(xì)胞的支架A組ColⅡ基因表達(dá)水平最高，和支架C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)