骨性關節(jié)炎關節(jié)液對滑膜間充質干細胞軟骨分化影響的研究.pdf

1、目的：
　　一直以來，軟骨缺損的修復都是骨科領域的難點和熱點，因為難以在軟骨缺損區(qū)重建真正的透明軟骨，以實現(xiàn)關節(jié)軟骨的功能。軟骨細胞移植的方法解決了這個問題，可以在軟骨缺損區(qū)形成透明軟骨，實現(xiàn)真正的關節(jié)軟骨的結構和功能，但這種方法需從自體正常軟骨取材，細胞來源有限，且存在多種并發(fā)癥。間充質干細胞具有高度增殖和多向分化能力，可大量增殖并分化為軟骨細胞，解決了自體軟骨細胞移植的弊端。目前研究表明，在骨髓、滑膜、脂肪、肌膜等不同組織來源

2、的間充質干細胞中，滑膜間充質干細胞(synovium-derived stem cells，SDSCs)在增殖和軟骨分化能力上優(yōu)于其他來源的間充質干細胞。骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床中的常見病，以軟骨退變和軟骨缺損為主要病理表現(xiàn)，常常導致嚴重的疼痛和功能障礙。如果用SDSCs作為種子細胞治療OA關節(jié)的軟骨缺損，需將SDSCs在體外增殖并誘導分化為軟骨細胞，再移植回軟骨缺損區(qū)，必然會處于OA關節(jié)內退變性炎癥環(huán)境中

3、，其軟骨形成能力可能會受到炎癥環(huán)境的影響，如果存在影響？如何影響，是抑制還是促進軟骨形成？SDSCs是否可以作為種子細胞治療OA關節(jié)的軟骨缺損？以上問題目前仍無答案。本實驗旨在研究OA關節(jié)的退變性炎癥環(huán)境是否對SDSCs的軟骨分化能力產(chǎn)生影響？如果存在影響，分析其影響方式，是抑制還是促進？探討SDSCs是否可以作為治療OA關節(jié)軟骨缺損的種子細胞？
　　方法：
　　本實驗首先在臨床中隨機選取隨因膝關節(jié)OA行關節(jié)置換的病人12例

4、，其中男4例，女8例，平均年齡64.4歲。提取手術中需切除的滑膜組織，并抽取關節(jié)液。將滑膜組織中的SDSCs進行分離培養(yǎng)，并傳代擴增，繪制MTS細胞增殖曲線，探討其細胞增殖能力。采用流式細胞術分析其間充質干細胞表面標記物:CD44、CD45、CD90、CD105的表達情況，并向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞誘導分化，采用組織化學染色方法觀察誘導結果。成軟骨誘導分化采用2種培養(yǎng)方法:平板培養(yǎng)和細胞團懸浮培養(yǎng)。鑒定分離培養(yǎng)的細胞是否為間充質干

5、細胞，并分析其軟骨分化形成能力。然后將成軟骨誘導分化后的細胞分為實驗組和對照組，在實驗組細胞培養(yǎng)基中加入OA關節(jié)液，模擬OA關節(jié)內的退變性炎癥環(huán)境。然后采用多種方法分析比較2組細胞的軟骨形成能力，采用實時定量PCR技術檢測常見透明軟骨標志性基因的表達情況，包括:COLⅡ、Aggrecan、SOX9基因，然后采用Westemblots方法檢測其相應蛋白的合成情況，并測量2組細胞團培養(yǎng)形成的軟骨小球的直徑。
　　結果：
　　本實

6、驗在體外條件下，從OA關節(jié)滑膜組織中成功分離出SDSCs，MTS細胞增殖曲線顯示SDSCs增殖能力強，細胞數(shù)量平均72小時擴增1倍。流式細胞術結果顯示CD45陰性，CD44、CD90、CD105陽性，多向誘導分化后細胞染色結果顯示可以向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞分化，并產(chǎn)生相應的細胞外基質。成軟骨誘導分化細胞團懸浮培養(yǎng)可見軟骨小球形成，以上說明OA關節(jié)滑膜組織中可以分離出SDSCs，并向軟骨細胞誘導分化，形成軟骨基質。實時定量PCR結

7、果顯示實驗組細胞Ⅱ型膠原(collagenⅡ，COLⅡ)、Aggrecan、SOX9基因mRNA的表達高于對照組，并具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，Western blots結果顯細胞COLⅡ、Aggrecan、SOX9蛋白的合成高于對照組，實驗組細胞團形成軟骨小球的直徑明顯大于對照組，并具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。說明OA關節(jié)液可以促進SDSCs的軟骨分化形成能力。
　　結論：
　　本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在體外條件下OA關節(jié)