骨碎補(bǔ)干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對兔關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.骨碎補(bǔ)干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)。2.觀測兔軟骨細(xì)胞-FN/PLGA/TGF-β1生物支架復(fù)合體對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法：1.進(jìn)行兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察、FCM檢測及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定；2.最佳濃度骨碎補(bǔ)干預(yù)兔 BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，通過 MTT法對細(xì)胞活性的檢測、免疫組化對Ⅱ型膠原的測定及甲苯胺藍(lán)染色檢測GAG的合成等方法觀察體外培養(yǎng)的兔BMSCs增殖分化的情況，

2、并以此得到軟骨細(xì)胞；3.將聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)生物支架切成4mm*4mm*4mm大小，消毒，將誘導(dǎo)好的第2代軟骨細(xì)胞以4×1010/L體外接種于PLGA生物支架上，體外培養(yǎng)7天，觀察細(xì)胞在支架內(nèi)的生長情況、形態(tài)及吸附、分布情況;行HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色，觀察軟骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及Ⅱ型膠原含量，并利用圖像分析軟件對Ⅱ型膠原免疫組化染色面積進(jìn)行分析；4.將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，分別在4周，8周，12周取樣

3、，觀察細(xì)胞-支架復(fù)合物對軟骨缺損的修復(fù)情況。
　　結(jié)果：1.①兔BMSCs成均勻分布的簇狀生長、形態(tài)梭形。在傳代培養(yǎng)中形態(tài)特性無明顯變化、均質(zhì)性提高，高表達(dá)CD44，不表達(dá)CD34，可證明為非造血干細(xì)胞。②骨碎補(bǔ)可以誘導(dǎo)兔BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞能分泌細(xì)胞外基質(zhì)，例如Ⅱ型膠原蛋白，用組織學(xué)檢查及Ⅱ型膠原抗體免疫熒光檢測證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。2.①HE染色對照組支架纖維組織有所增加，未見成軟骨細(xì)胞和軟骨

4、組織，支架被少許骨基質(zhì)及纖維組織填充;試驗(yàn)組支架降解成網(wǎng)狀并被吸收，成軟骨區(qū)圓形、橢圓形、多邊形成軟骨細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)逐漸增多，生成少量軟骨組織，并見少量多核的破骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)；空白組僅見少量淋巴細(xì)胞和纖維細(xì)胞，未見軟骨細(xì)胞。②Ⅱ型膠原染色細(xì)胞支架組軟骨區(qū)域PLGA生物支架逐漸降解減少，Ⅱ型膠原染色陽性逐漸增強(qiáng)，類軟骨樣組織逐漸增多，術(shù)后12周后可見少許類軟骨樣組織；對照組和空白組術(shù)后Ⅱ型膠原染色均為陰性。③甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞支架組術(shù)后4

5、至8周甲苯胺藍(lán)染色陽性逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞核外類軟骨樣組織逐漸增多，術(shù)后12周有類軟骨樣組織生成；對照組和空白組各檢測周期甲苯胺藍(lán)染色陰性。3.電鏡掃描細(xì)胞支架組成軟骨區(qū)可見大量圓形、橢圓形軟骨細(xì)胞；對照組掃描電鏡下表面較粗糙，孔隙較多，大小不一，孔隙間多有交通，未發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞；空白組電鏡下未發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞生成。
　　結(jié)論：1.通過體外對兔BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定，可建立較完善的BMSCs培養(yǎng)體系；骨碎補(bǔ)各組與陽性對照組相比誘導(dǎo)作用弱，