Peyer小結(jié)B淋巴細胞分化過程中S1P1表達變化及Tfh相關(guān)因子對B淋巴細胞S1P1表達的影響.pdf

1、目的:
　　研究S1P1在不同分化階段B淋巴細胞(B220+IgA-B淋巴細胞、B220+IgA+B淋巴細胞、B220-IgA+漿母細胞)的表達以及Tfh細胞因子IL-4、IL-21、TGF-β1等對S1P1表達的影響。
　　方法:
　　1.選用BALB/c小鼠,采用隔日口服0.1％牛血清白蛋白(BSA),兩周后將小鼠斷頸處死,取小腸段Peyer小結(jié)免疫組化染色,觀察不同分化階段的B淋巴細胞在Peyer小結(jié)中的定位及S

2、1P1的分布情況。
　　2.流式細胞術(shù)檢測Peyer小結(jié)細胞膜表面S1P1在(B220+IgA-B淋巴細胞、B220+IgA+B淋巴細胞、B220-IgA+漿母細胞)這三種細胞群中的表達情況。
　　3.選用BALB/c小鼠,無菌條件下采用密度梯度離心法獲取脾臟單個核細胞。磁珠分選法獲得純度為95%以上的B220+細胞,分別加用IL-4、IL-21、TGF-β1孵育,于加入后0h、24h、48h、72h、96h收集細胞,流式細

3、胞術(shù)檢測IL-4、IL-21和對照組細胞膜表面S1P1的表達情況,判斷這兩個細胞因子對S1P1表達的影響。
　　4.對TGF-β1干預(yù)組及其對照組在24h、48h、72h提取細胞總蛋白,IL-4、IL-21干預(yù)組及其對照組在24h、96h、120h提取細胞總蛋白,Western-blot檢測不同組別S1P1的表達。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化結(jié)果表明,Peyer小結(jié)生發(fā)中心存在大量B220+細胞,IgA+細胞散在分布

4、于生發(fā)中心的明帶與暗帶,在明帶偶可見其成團分布。CD138+細胞在生發(fā)中心暗帶區(qū)可見散在分布。S1P1+細胞在生發(fā)中心明帶與暗帶均可見分布,以中央明帶區(qū)數(shù)目更多。
　　2.流式細胞術(shù)檢測Peyer小結(jié)細胞,測得細胞膜表面S1P1在B220+IgA-B細胞熒光率為(9.673±4.302)%,在B220+IgA+B細胞為(36.39±9.193)%,在B220-IgA+漿母細胞為(52.91±8.185)%。并且B220+IgA-B

5、細胞與B220+IgA+B細胞相比,P<0.05;B220+IgA-B細胞與B220-IgA+漿母細胞相比,P<0.005;B220+IgA+B細胞與B220-IgA+漿母細胞相比,P>0.05。
　　3.細胞因子干預(yù)后的B220+細胞流式細胞術(shù)檢測細胞膜表面S1P1發(fā)現(xiàn),IL-4(200ng/107cells)干預(yù)0h,24h,48h,72h,96h后,S1P1表達細胞百分率為3.02±1.232,6.23±3.600,5.75

6、±3.216,11.86±3.614,38.36±5.558;IL-21(100ng/107cells)干預(yù)0h,24h,48h,72h,96h后,S1P1表達細胞百分率分別為1.87±0.578,5.92±2.772,7.56±4.228,20.65±3.791,46.77±7.893;IL-4(200ng/107cells)與IL-21(100ng/107cells)共同干預(yù)0h,24h,48h,72h,96h后,S1P1表達細胞百

7、分率分別為2.77±1.103,5.45±2.113,8.40±1.472,14.13±4.221,43.77±3.316;而未加細胞因子的對照組0h,24h,48h,72h,96h后分別為2.34±0.910,2.26±1.220,5.22±1.571,9.383±6.548,15.16±4.327。從結(jié)果中可以看出,各干預(yù)組與對照組在0到48h之間細胞膜表面S1P1表達量無明顯差異,從72h到96h,各干預(yù)組S1P1表達量出現(xiàn)明顯上

8、升,說明IL-4與IL-21對B220+細胞上調(diào)細胞膜S1P1受體有促進作用。
　　4.Western-blot結(jié)果顯示,TGF-β1刺激后的B220+細胞,其S1P1的表達量在24h、48h、72h呈上升趨勢(時間點之間P<0.05),且高于對照組(24hP=0.0003,48hP=0.0006),說明TGF-β1對于B220+細胞上調(diào)S1P1表達有促進作用;IL-4、IL-21、IL-4和IL-21刺激組S1P1表達量在24h

9、到96h之間呈明顯上升趨勢,且明顯高于對照組,但96h到120h之間增長不明顯。
　　結(jié)論:Peyer小結(jié)內(nèi)B淋巴細胞經(jīng)歷B220+IgA-、B220+IgA+、B220-IgA+幾個階段,不斷分化成熟,且逐漸從生發(fā)中心的暗帶區(qū)遷移至FDC較多的明帶區(qū),在這里接觸FDC提呈的抗原并受到CD4+T細胞進一步活化發(fā)育成漿細胞。而S1P1受體的表達量亦隨其分化成熟不斷上調(diào),使其更易受S1P的趨化進入輸出淋巴系統(tǒng)。Tfh細胞因子TGF-β