B淋巴細胞刺激因子對B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞生長調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景及目的：B淋巴細胞刺激因子（B lymphocyte stimulator，BLyS）是一種與免疫相關(guān)的細胞生長因子，體外實驗證明，BLyS作為一種B淋巴細胞的共刺激因子，在anti-IgM或CD40L的預(yù)刺激下，可以對B細胞有強烈的促進增殖和刺激分泌免疫球蛋白的作用，在體液免疫中具有重要作用。動物實驗證實，BLyS缺陷或過度表達均能引起機體的免疫失衡，誘發(fā)多種疾病。目前關(guān)于BLyS與人免疫性疾病，尤其是與B細胞惡性腫瘤形成和發(fā)

2、展關(guān)系的研究尚處于起步階段，正成為其診斷和治療研究的一個新熱點。本研究中，用BLyS處理人淋巴瘤細胞株Raji細胞后，應(yīng)用MTT法、流式細胞技術(shù)和免疫細胞化學(xué)等方法，分析BLyS對B淋巴瘤細胞增殖、化療藥物誘導(dǎo)的凋亡及凋亡相關(guān)通路（NF-KB、JNK、P38）的影響；探討B(tài)LyS在B淋巴瘤細胞生長調(diào)控中的作用及可能的作用機制。
　　 方法：
　　 1、MTT法檢測BLyS在Raji細胞增殖中的作用：體外培養(yǎng)人淋巴瘤細胞株

3、Raji，采用四甲基偶氮唑藍（tetrzolium-based colorimetric assay，MTT）比色法檢測（1）BLyS不同濃度組（0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，）、不同時間組（24h，48h，72h）對Raji細胞增殖的影響。（2）BLyS不同濃度組（0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，）、不同時間組（24h，48h，72h）和共刺激分子anti-IgM共同作用對Raji細胞增殖的影

4、響。
　　 2、流式細胞術(shù)檢測BLyS對化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡的影響：實驗組加入相同濃度的VP-16（0.5μg/ml）和不同濃度（0.25μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml）的BLyS，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測BLyS對VP-16誘導(dǎo)的Raji細胞凋亡的影響。
　　 3、應(yīng)用免疫細胞化學(xué)的方法定性觀察BLyS影響化療藥物誘導(dǎo)Raji細胞凋亡過程中NF-KB、JNK、P38蛋白表達的變化。
　　 結(jié)果：

5、r>　　 1、體外細胞增殖實驗（MTT）結(jié)果顯示，BLyS對人淋巴瘤細胞株Raji細胞具有明顯的促增殖作用。不同濃度（0.25μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml）BLyS處理Raji細胞24～72h后，與對照組相比，各處理組OD值均有不同程度增大，差異有顯著性（p<0.05）。且隨著BLyS濃度的增加、作用時間的延長，OD值逐漸增大。即BLyS對Raji細胞的促增殖作用呈明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。不同濃度（0.25

6、μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml）的BLyS和anti-IgM（10μl）共同作用也能促進Raji細胞增殖，差異有顯著性（p<0.05）。將相同濃度的BLyS單獨作用組與anti-IgM共同作用組兩兩比較發(fā)現(xiàn)：當(dāng)BLyS濃度為0.25μg/ml時兩組在24h、48h、72h時對B細胞的增殖作用無明顯差異（p>0.05）。當(dāng)BLyS濃度為0.50μg/ml、1.00μg/ml時與單獨加入BLyS相比，anti-IgM共同作用組，

7、B細胞的增殖幅度更大，差異有顯著性（p<0.05）。說明BLyS與anti-IgM在刺激B淋巴細胞增殖上具有協(xié)同性作用。
　　 2、流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：Raji細胞經(jīng)化療藥物VP-16處理48小時后，流式細胞儀測得典型的亞二倍體凋亡峰，當(dāng)加入VP-16同時加入BLyS后，細胞凋亡受到明顯抑制，且隨著BLyS濃度的增加，凋亡率逐漸降低。當(dāng)BLyS的濃度為0μg/ml，0.25μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml時，Raj

8、i細胞凋亡率分別為18.32％，14.56％，7.39％，3.28％。說明BLyS能夠抑制化療藥物VP-16誘導(dǎo)的細胞凋亡，且抑制作用呈明顯的劑量依賴性。
　　 3、免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示：對照組Raji細胞中NF-κB染色強度呈弱陽性，彌漫分布于細胞質(zhì)和細胞核。與對照組相比，單獨加入VP-16，NF-κB表達無明顯變化，當(dāng)加入VP-16同時加入BLyS后，陽性細胞數(shù)量明顯增加，核染色強度明顯增強。對照組Raji中JNK、P3

9、8染色強度呈弱陽性，彌漫分布于細胞質(zhì)和細胞核；VP-16處理后細胞核染色強度明顯增強，陽性細胞數(shù)增加，當(dāng)加入化療藥物同時加入BLyS，與單獨加入化療藥物VP-16組相比，細胞染色強度減弱，陽性細胞數(shù)減少。
　　 結(jié)論：
　　 1、BLyS促進人淋巴瘤細胞株Raji細胞增殖，且anti-IgM與BLyS在刺激B淋巴瘤細胞增殖上具有協(xié)同性作用。
　　 2、BLyS抑制化療藥物VP-16誘導(dǎo)的Raji細胞凋亡。