多硫酸化硫酸軟骨素的制備、性質及其口服制劑對兔膝骨關節(jié)炎的關節(jié)保護作用.pdf

1、隨著世界人口進入老齡化，骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的患病率不斷上升，患病人群日益增多。OA會導致疼痛、殘疾，嚴重影響患者的勞動能力。OA發(fā)生時，首先受到損傷的是關節(jié)軟骨。關節(jié)軟骨變薄、變性、破壞，軟骨下骨硬化、關節(jié)間隙狹窄。對OA的治療目前常用非甾體類抗炎藥和多糖類軟骨保護劑。多糖類軟骨保護劑一般都是肝素類似物，如多硫酸氨基聚糖、多硫酸戊糖鈉、多硫酸糖胺聚糖等。它們的作用是維持關節(jié)軟骨的蛋白多糖含量，刺激軟骨細胞合成

2、Ⅱ型膠原及蛋白多糖，從而有助于維持關節(jié)軟骨完整性。 硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate，CS)是關節(jié)軟骨的重要成分，是由重復雙糖→4)-β-D-GlcUA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→構成的糖胺聚糖。OA發(fā)生時，軟骨受到損害，CS含量下降。補充CS能有效緩解癥狀，減輕炎癥區(qū)域的腫脹度、下調基質金屬蛋白酶-9，減輕OA對軟骨的損害；還可能降低發(fā)病率、關節(jié)溫度、痛感。臨床上已有CS的復方口服藥物或膳食補充

3、劑，用于骨關節(jié)炎患者的治療和保健。而深入研究發(fā)現，CS由于糖鏈上硫酸基位置的不同具有多種異構體。目前使用的CS藥物多從動物軟骨組織提取，其成分多是4-硫酸軟骨素(CSA)和6.硫酸軟骨素(CSC)。而在人關節(jié)軟骨中主要含有的是4，6-二硫酸軟骨素(CSE)。體外實驗發(fā)現，當模擬OA發(fā)生時，培養(yǎng)的軟骨組織中4，6-雙硫酸軟骨素含量下降，而有針對性的補充4，6-雙硫酸軟骨素在低濃度即可刺激軟骨基質合成，并抑制蛋白酶合成，具有顯著的軟骨保護效

4、應。提示硫酸根和其負電荷可能對OA的發(fā)病和治療都非常重要。 為開發(fā)針對OA發(fā)病機制的特異性的軟骨保護劑，本課題采用氯磺酸.甲酰胺磺化法對4-硫酸軟骨素進行多硫酸化衍生，制備了含有4,6-雙硫酸軟骨素結構的多硫酸化硫酸軟骨素(Polysulfated chondroitin sulfate，PSCS)，使硫酸軟骨素帶上更多的負電荷，改變了其構象。由于PSCS是帶有大量負電荷的大分子，口服不易吸收，要開發(fā)成口服治療OA的藥物，需要制

5、備成帶負電荷少、容易吸收的口服制劑。因此我們研究了PSCS的制備、鑒定、劑型及對兔膝OA的藥理活性。 1 PSCS的制備、純化及性質用氯磺酸-甲酰胺磺化法對CS進行多硫酸化，制備PSCS。通過SO42-含量測定和SO42-/COO-比值測定驗證磺化結果，SO42-含量從12.76％上升到20.62％，增加了7.76％；SO42-/COO-比值從1.35上升到3.35。產率達78.9％。對產物PSCS進行毛細管電泳分析和高效液相色譜分析，

6、均只出現一個對稱尖峰，證明所得產品較純。并測定了其理化性質，包括糖醛酸含量、氨基己糖含量、絕對分子量、比旋度等。同時測定了PSCS的抗凝效價為40usp/mg。說明PSCS具有一定的抗凝活性。 2.PSCS的結構研究用UV、IR、1H-NMR和13C-NMR分析了PSCS的結構。UV顯示，樣品不含共軛雙鍵，也不含有蛋白質和核酸等雜質。經與CS紅外光譜對比，證實了PSCS具有CS基本母鏈結構，即含有葡萄糖醛酸與半乳糖胺雙糖單位，吡

7、喃糖為β構型。并且在PSCS的IR上出現了硫酸基加在了半乳糖胺6位碳上的特征吸收峰818cm-1，可以判斷半乳糖胺6位碳上羥基被硫酸基取代。經過1H-NMR和13C-NMR進一步解析，葡萄糖醛酸的C-2、C-3位都連接上了硫酸基。PSCS主要雙糖結構應該為由2，3位硫酸化的葡萄糖醛酸和4，6位O硫酸化的半乳糖胺組成→4)-β-D-GlcUA(2S,3S)-(1→3)-β-D-GalNAc(4S,6S)-(1→。 3.PSCS口服

8、制劑的制備篩選了PSCS-殼聚糖納米粒劑型的制備條件和方法。其優(yōu)化條件為：殼聚糖的分子量為5kDa，其濃度為2mg/ml，溶液的pH6.0，加入的PSCS濃度為1mg/ml，體積為殼聚糖溶液的四分之一，滴加速度為2秒/滴，滴加時殼聚糖反應液渦旋轉速為600r/min。所得PSCS-殼聚糖納米粒徑在200nm左右，所帶電荷為+46mV左右。具有較好的均一性、圓整度和穩(wěn)定性。 4 PSCS對兔膝骨關節(jié)炎的軟骨保護作用用兔膝關節(jié)腔內注

9、射Ⅱ型膠原酶建立了骨關節(jié)炎早期模型。 每日灌胃給PSCS-殼聚糖納米粒，持續(xù)4w。行為學、影像學、病理學檢測證實了口服PSCS-殼聚糖納米粒對兔膝骨關節(jié)炎具有一定的療效。行為學觀察可見口服給藥PSCS,對骨關節(jié)炎的膝疼痛有一定緩解作用。X光片顯示，模型組關節(jié)面粗糙，關節(jié)間隙變窄，有疑似骨贅。而用藥組關節(jié)面較光滑，關節(jié)間隙只是略有變窄，無骨贅。剝離軟骨，觀察軟骨表面：用藥組關節(jié)軟骨表面與模型組相比，軟化灶更少，光澤度更好。觀察軟骨

10、HE染色病理切片，顯示PSCS用藥組能有效保護軟骨表面完整性和深層細胞及結構；經Markin評分，結果顯示，模型組為5.76±3.23，PSCS低劑量組為3.98±1.88，PSCS高劑量組為3.32±2.02。PSCS高、低劑量組與模型組相比都具有統計學差異，說明低劑量PSCS即具有一定的緩解軟骨退行性變的作用?？梢哉J為PSCS具有一定的軟骨保護功能。 檢測了兔血清中TNF-α和IL-1β的含量。PSCS低劑量組TNF-α含量

11、為8.98±1.98pg/Ml，與模型組18.76±1.23pg/ml相比具有顯著性差異，說明PSCS能有效抑制骨關節(jié)炎模型兔血清中TNF-α的增高，且與陽性藥物組9.92±1.16pg/ml的效果無統計學差異。IL-1β的含量PSCS組與模型組對比無顯著性差異。 本課題取得的主要成果： 成功的制備了純度較高的多硫酸化硫酸軟骨素PSCS，并確認了它含有4，6-雙硫酸軟骨素結構。 成功的制備了PSCS-殼聚糖納米粒