小麥種子蛋白及赤霉病抗性相關(guān)基因的分子鑒定.pdf

1、依據(jù)功能不同可將種子蛋白劃分為貯藏功能的谷醇溶蛋白和維持正常代謝功能的非醇溶性蛋白兩類。高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)屬于種子醇溶性蛋白，優(yōu)質(zhì)HMW-GS可明顯改善小麥加工品質(zhì)。小麥近緣屬種中廣泛存在的HMW-GS等位變異基因可能成為小麥品質(zhì)改良的重要基因資源。麥類作物種子中還富含屬于種子非醇溶性蛋白中清蛋白的α-淀粉酶抑制因子(AAI)，能有效抑制內(nèi)源或外源α-淀粉酶活性，控制種子穗發(fā)芽、抑制昆蟲繁殖。赤霉病是小麥主要病害之一，易

2、感染開花期的小穗和發(fā)育早期的籽粒。赤霉菌會擾亂種子貯藏蛋白的合成或者消耗種子中的蛋白、糖來供自己繁殖，從而破壞發(fā)育中的籽粒。本文對小麥種子蛋白HMW-GS、AAI進行了基因克隆、與進化分析，并對抗赤霉菌材料的基因表達譜進行了分子鑒定，主要結(jié)果如下： 1.從二倍體長穗偃麥草中分離并鑒定了4個新型HMW-GS編碼基因，分別編碼x-型亞基(Ee2.1、Ee1.9)與y一型亞基(Ee1.8、Ee1.5)。其中，Ee2.1和Ee1.5各存

3、在1個與普通小麥HMW-GS相比特殊的Cys，推測這兩個亞基在小麥品質(zhì)育種中具有潛在利用價值。對小麥族不同物種HMW-GS的N-端序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，x-型和y-型HMW-GS均具有很高的同源性，但y-型HMW-GS變異程度比x-型亞基小。依據(jù)是否存在15bp或24bp的堿基插入將x-型HMW-GS及其編碼基因劃分為3種類型。系統(tǒng)進化分析表明，HMW-GS編碼基因在漫長的基因復(fù)制過程中相對獨立，且一直保持著其生物學(xué)功能。來自普通小麥A

4、、B、D基因組的HMW-GS存在明顯差異，具有染色體組特異性。 2.從普通小麥及近緣物種中克隆獲得與昆蟲抗性有關(guān)的635個二聚α-淀粉酶抑制因子編碼基因(WDAI)，377個單聚α-淀粉酶抑制因子(WMAI)和20個四聚α-淀粉酶抑制因子(WTAI)編碼基因序列。對α-淀粉酶抑制因子序列與功能分析，探討了該家族成員間的理化、功能(如等電點、遷移率、對蛋白酶的抑制范圍和活性)差異的分子基礎(chǔ)。建立了一種利用序列中SNP位點開發(fā)出特異

5、標(biāo)記引物將功能基因定位于普通六倍體小麥具體基因組的方法，由此將來自普通小麥的WDAI基因定位在3BS和3DS上。雖然從A基因組一粒系小麥中得到了WDAI、WMAI編碼基因序列，但分子證據(jù)揭示普通小麥A基因組不含有WDAI編碼基因，而是否含有WMAI編碼基因則需要進一步研究。依據(jù)序列特征，推測小麥及其近緣物種中WDAI源于共同的祖先基因，而小麥及山羊草的WMAI也可能由一共同的祖先基因通過復(fù)制與突變進化而來，但是WMAI相似性明顯比WDA

6、I高，變異程度更低。 3.依據(jù)序列分析發(fā)現(xiàn)二倍體一粒系小麥由于堿基插入導(dǎo)致無α-淀粉酶抑制因子活性的分子基礎(chǔ)。一粒系小麥中WDAI編碼基因差異與基因組來源有關(guān)，與地理來源關(guān)系不明顯。Am基因組的WDAI基因與Au基因組的基因相比進化速率更慢、變異程度更低。依據(jù)普通小麥B基因組和擬斯卑爾托山羊草組S(S、Sl、Ss、Ssh“和Sb)基因組159個WDAI基因序列中SNP位點差異，共發(fā)現(xiàn)59種呈“星”形分布的單倍型，并可歸為5個主要

7、的單倍型組。普通小麥和野生二粒小麥B基因組上的WDAI基因與來自擬斯卑爾脫山羊草S基因組上的WDAI基因最相似，但是推測多個擬斯卑爾托山羊草組物種可能通過種間雜交時的基因漸滲參與了多倍體小麥B基因組WDAI基因位點的形成。小麥族11個屬20個基因組的WDAI基因的分子系統(tǒng)進化分析表明，WDAI編碼基因差異與基因組系統(tǒng)進化有關(guān)，且在基因組分化以前該位點就已經(jīng)存在。這些結(jié)果為深入了解WDAI基因位點上基因重組、整合事件及發(fā)生過程提供了重要信

8、息，有助于加深對WDAI功能的了解。 4.對以色列野生二粒小麥α-淀粉酶抑制因子基因的遺傳結(jié)構(gòu)、分化程度及其與生態(tài)因子間的關(guān)系進行了系統(tǒng)研究。WMAI序列所包含遺傳信息較低；WTAI序列同樣非常一致。無論是在居群內(nèi)還是居群間，野生二粒小麥WDAI基因位點都存在變異，居群間遺傳距離與地理來源關(guān)系密切。野生二粒小麥WDAI基因序列ω值(Ka/Ks)大于1，表明該基因位點為正選擇位點，存在明顯的選擇壓力導(dǎo)致WDAI基因序列產(chǎn)生多樣性及

9、遺傳和功能差異。WDAI編碼基因中SNP標(biāo)記所揭示的16個居群遺傳多樣性指數(shù)(P)、Nei’s基因多樣性(He)和Shannon指數(shù)(I)分別為0.887、0.404和0.589。SNP服從于自然選擇，生態(tài)因子單獨或聯(lián)合作用導(dǎo)致WDAI基因序列中SNP位點的多樣性，特別是幾個水分因子對SNP位點有極顯著影響，推測水分作為主要選擇壓力通過影響昆蟲數(shù)量間接影響α-淀粉酶抑制因子遺傳結(jié)構(gòu)變異、分化程度。 5.獲得與過敏性哮喘相關(guān)的小麥

10、種子潛在變應(yīng)原編碼基因。利用生物信息學(xué)手段對小麥種子蛋白質(zhì)變應(yīng)原與公認主要變應(yīng)原α-淀粉酶抑制因子進行了比較，并預(yù)測編碼蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)。由于過敏哮喘與由IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)有關(guān)，推測這些蛋白質(zhì)具有能與IgE結(jié)合相似的結(jié)構(gòu)域。 6.對一套中國春.長穗偃麥草附加系、代換系、端體異附加系材料的赤霉病抗性進行了評價，發(fā)現(xiàn)7E附加系(CS-7E)和7ES端體異附加系(CS-7ES)抗性最強，推測7E染色體上存在潛在的赤霉病抗性基因或能誘導(dǎo)

11、/抑制普通小麥CS上抗性/易感基因表達的調(diào)控基因。利用基因芯片對CS、CS-7E、CS-7ES在赤霉菌誘導(dǎo)0-96小時后的表達譜進行了分析，初步篩選出70個赤霉病菌誘導(dǎo)差異表達的抗性相關(guān)基因：生物信息學(xué)比對和功能注解發(fā)現(xiàn)，候選基因所編碼蛋白質(zhì)或是屬于某些特定的生理生化代謝途徑關(guān)鍵酶、或是已知功能真菌誘導(dǎo)抗性應(yīng)答蛋白、或與生物或非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)。利用實時定量PCR對16個候選基因的表達水平進行了驗證，與芯片數(shù)據(jù)相比基因表達水平變化的方向