普通小麥感赤霉病突變體的鑒定和望水白及其感病突變體受赤霉病菌誘導(dǎo)的基因差異表達(dá)分析.pdf

1、小麥赤霉病是一種主要由禾谷鐮刀菌引起的世界性流行病害，該病廣泛發(fā)生在世界溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)，嚴(yán)重危害小麥產(chǎn)量、品質(zhì)和糧食安全生產(chǎn)。選育抗赤霉病小麥品種是控制麥類赤霉病最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保和有效的途徑。中國是世界上開展小麥抗赤霉病研究最早的國家之一。自20世紀(jì)50年代開始，國內(nèi)外學(xué)者就針對小麥赤霉病病原菌的致病菌種、致病性、致病機(jī)理及抗源篩選、抗性鑒定技術(shù)、抗赤霉病性遺傳、抗病基因定位、抗性生理生化機(jī)制、抗性育種等方面做了大量研究，并取得了較為

2、顯著的進(jìn)展，然而有關(guān)小麥抗赤霉病相關(guān)基因克隆的研究報道很少，對小麥抗赤霉病的分子機(jī)制更是缺乏全面系統(tǒng)的理解和認(rèn)識。突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料，創(chuàng)造感霉病突變體，對于研究抗病機(jī)理和克隆抗病基因具有重要意義。小麥品種蘇麥3號和望水白是兩個最重要的小麥種內(nèi)赤霉病抗源，本研究利用快中子輻照蘇麥3號和望水白成熟干種子，在后代中篩選出多個感赤霉病的突變體，比較了望水白感赤霉病突變體NAUH117在形態(tài)、病源菌侵染過程、基因表達(dá)的差異，對突變

3、體感病性進(jìn)行遺傳分析，并在突變體NAUH117的染色體缺失區(qū)段上克隆了1個受體蛋白激酶基因。本研究的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.蘇麥3號和望水白感赤霉病突變體的獲得和鑒定
　　 蘇麥3號和望水白是高抗赤霉病的小麥品種，其抗性是由核內(nèi)多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，本研究通過快中子輻照蘇麥3號和望水白成熟干種子，在后代中獲得了多個突變體，從M5代到M8連續(xù)四年應(yīng)用小穗單花滴注接種和一年應(yīng)用孢子液噴霧接種對突變體進(jìn)行赤霉病抗性鑒

4、定，鑒定了8個赤霉病抗性相對各自野生型對照有顯著性降低的感赤霉病突變體。利用已報道的與17個抗赤霉病QTLs連鎖的分子標(biāo)記對這8個突變體進(jìn)行分析，有4個突變體在3BS發(fā)生缺失，有1個突變體在5DS發(fā)生缺失，另外3個突變體突變位點(diǎn)與上述5個突變體不同，還需要進(jìn)一步鑒定。
　　 2.望水白感赤霉病突變體NAUH117表型、分子標(biāo)記鑒定和感病位點(diǎn)遺傳分析
　　 1)望水白及其感赤霉病突變體NAUH117赤霉菌侵染過程比較:以G

5、FP標(biāo)記赤霉菌Chi-2侵染小麥穗部，在熒光體式鏡下通過觀察綠色熒光信號分布來監(jiān)視赤霉菌動態(tài)侵染過程。比較赤霉菌侵染望水白和NAUH117過程發(fā)現(xiàn)，赤霉菌可以通過小穗軸基部侵入到NAUH117的穗軸，并在穗軸中擴(kuò)展，感染臨近小花或小穗;而赤霉菌不能或很難透過望水白小穗軸基部進(jìn)入穗軸內(nèi)部。
　　 2) NAUH117的感病位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定:利用定位于除3BS以外的其他染色體上的796個SSR、STS等分子標(biāo)記和定位于3BS上的8

6、6個SSR、STS和ISBP標(biāo)記在望水白和NAUH117間擴(kuò)增，結(jié)果表明，只有定位于3BS上的部分標(biāo)記在兩個材料間有差異擴(kuò)增，其他標(biāo)記均未擴(kuò)增出差異條帶。對3BS上的分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步分析表明，位于3BS染色體區(qū)段FL0.57-1之間的標(biāo)記都不能在NAUH117中擴(kuò)增出3B特異條帶，而本研究所用的位于3BS FL0.56-0.57之間的4個標(biāo)記中，有兩個可以擴(kuò)增出3B特異條帶，有兩個不能擴(kuò)增出3B特異條帶，表明NAUH117在3BS

7、上存在染色體區(qū)段的缺失，缺失斷點(diǎn)位于3BS FL0.56-0.57區(qū)間，由于前人定位的3BS上的QTL位于FL0.78-0.87，推測由于該QTL的缺失是NAUH117感病的主要原因。
　　 3) NAUH117感病位點(diǎn)的遺傳分析:配置了望水白和NAUH117雜交組合，抗性鑒定結(jié)果表明，正反交F1所有單株的赤霉病抗性水平都與望水白相同，F(xiàn)2群體出現(xiàn)抗感分離，在436個F2株群體發(fā)現(xiàn)102個感病單株，x2測驗(yàn)表明抗感分離比例符合3

8、∶1，表明NAUH117感病是核內(nèi)單基因控制的隱性突變;對F2群體的分子標(biāo)記分析進(jìn)一步證實(shí)，NAUH117感病根本原因在于3BS上已經(jīng)定位的一個抗FHB主效QTL發(fā)生了缺失。
　　 3.應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析赤霉菌侵染望水白和NAUH117基因表達(dá)譜差異
　　 利用Affymetrix小麥基因表達(dá)譜芯片分別分析了望水白和NAUH117接種赤霉菌相對于接種水對照的基因表達(dá)變化，篩選出望水白和NAUH117受赤霉病誘導(dǎo)的上調(diào)和

9、下調(diào)差異表達(dá)基因。選擇7個在望水白中受赤霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的探針序列設(shè)計引物進(jìn)行半定量RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，表明芯片結(jié)果可靠。受赤霉菌誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因在望水白和NAUH117中有的是共同的，有的是各自特有的。相對于NAUH117，望水白中特異差異表達(dá)基因、特別是特異上調(diào)表達(dá)基因在抗病中發(fā)揮重要作用，這些基因包括信號接收和傳導(dǎo)相關(guān)基因、與細(xì)胞衰老凋亡有關(guān)基因、病程相關(guān)蛋白基因和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白或蛋白酶基因等;而望水白和NAUH

10、117共同上調(diào)表達(dá)基因涉及了乙烯通路、茉莉酸信號通路、苯丙烷代謝等通路中的多個基因，推測這些抗病通路參與了抗赤霉病反應(yīng);NAUH117中也有一些特有的上調(diào)表達(dá)的基因，它們可能與3BS上QTL以外的其它望水白抗赤霉病QTL的抗病通路有關(guān)。
　　 4.望水白3BS抗赤霉病主效QTL Fhb1附近一個受體蛋白激酶基因的克隆
　　 根據(jù)芯片雜交結(jié)果，結(jié)合望水白3BS抗赤霉病主效QTL區(qū)域與短柄草的比較基因組分析，本研究選擇一個在

11、望水白中受赤霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的探針設(shè)計引物，利用RACE技術(shù)在望水白中克隆了1個受體蛋白激酶基因，該基因全長1843bp，編碼380個氨基酸，經(jīng)SMART軟分析，該基因編碼了一種跨膜蛋白，在N端具有22氨基酸信號肽序列，并且包含由約80個氨基酸組成的未知功能胞外區(qū)，中央位置是由28個氨基酸組成的疏水跨膜區(qū)域;C端包括一個由211個氨基酸組成絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(S/TPK)胞內(nèi)域，具有這種蛋白結(jié)構(gòu)的基因?yàn)槭荏w類蛋白激酶(recepto

12、r-like Kinase，RLKs)，將該基因暫時命名為TaNRLK-B。利用缺體-四體和缺失系將該基因定位于小麥3BS FL0.78-0.87區(qū)域，即望水白Fhb1所在區(qū)域。半定量RT-PCR和Q-PCR均表明，TaNRLK-B受赤霉菌誘導(dǎo)在望水白中上調(diào)表達(dá)。但由于該基因在NAUH117中缺失，因此在NAUH117中利用RT-PCR未檢測到其表達(dá)。本研究分別構(gòu)建了該基因超量表達(dá)載體和RNAi干擾載體，并分別利用莖尖轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化法